Полностью автономные характеристика и сбора данных от кристаллов биологических макромолекул
22 марта 2019 г.
Здесь мы опишем, как использовать автоматизированной проверки и параметры сбора данных доступны на некоторых Синхротронное излучение. Ученые отправить образцы cryocooled синхротрон, дифракционные свойства проверяются, наборы данных собираются и обрабатываются и, где это возможно, структура решения осуществляется — все это без вмешательства человека.
Рентгеновская кристаллография является доминирующим методом для определения 3D структурной информации из белков. Линии синхротронного луча необходимы для получения данных из небольших, слабо диффрактных кристаллов, которые производят белки. Массивная линия представляет собой уникальную линию луча, поскольку полностью автоматизирует процесс сбора данных с биологических макромолекул.
Из выборки монтажа, местоположения и окончательного сбора данных. Полная автоматизация такого рода очень важна, так как позволяет исследователям проводить время в лаборатории, а не собирать данные на линии луча. Линия луча также умна и в среднем может собирать лучшие данные, чем когда линия луча управляется людьми.
Чтобы начать этот протокол, выполните кристаллическое монтажное и запросите время луча на Massive, как описано в текстовом протоколе. Перейдите на информационную систему для белковых кристаллических лучей, или веб-сайт ISPyB. Выберите эксперименты MX, воймить с номером эксперимента и паролем.
Нажмите на отгрузку, добавьте новую и предоставьте необходимую информацию. Затем нажмите сохранить. Нажмите добавить посылку и заполнить запрашиваемую информацию.
Нажмите сохранить, а затем нажмите добавить контейнер. Дайте шайбе штрих-код в качестве имени, и выбрать позвоночник шайбу, снова нажмите сохранить. Нажмите на символ контейнера и редактировать, и заполнить необходимую информацию о образцах, таких как название белка, предпочтительный поток работы, и кристаллическое положение, в шайбе.
Выберите белок, одобренный группой безопасности ESRF. Введите уникальное имя образца для идентификации каждого отдельного образца. По желанию сканируйте штрих-код пин-кода.
Остальная часть информации, которую нужно включить, также необязательна. Для каждого отдельного образца введите тип эксперимента. Это определяет, какой автоматический рабочий процесс будет использоваться для обработки каждого кристалла.
Учитывая, что кристаллы GCSH являются иглами, выберите MX нажмите P.Next, введите космическую группу. При наличии этого средства они будут использоваться для расчетов стратегии сбора данных и автоматических линий обработки данных. Введите нужное разрешение.
Это определяет расстояние кристалла до детектора от первоначального сканирования сетки, характеристики и сбора данных по умолчанию. Теперь установите желаемое пороговое разрешение, чтобы предотвратить сбор полных наборов данных из кристаллов, которые не диффрактировать до этого предела. Это может сэкономить место для хранения данных и проанализировать время.
Установите требуемую полноту. Затем установите требуемую множественность. Если на поддержке образца содержится более одного кристалла, установите максимальное количество кристаллов, которые будут проанализированы.
Значение по умолчанию составляет один или пять для MX нажмите P.Соответствующий размер луча также может быть выбран. Поместите в космическую группу, если это известно, в столбец космической группы силы. Затем установите радиационную чувствительность кристаллов.
При желании установите общий угол вращения, который будет собран для полного сбора набора данных. После ввода всей информации в систему сохраните значения. Нажмите на кнопку, вернитесь к отгрузкам и нажмите отправить отгрузку в ESRF.
Печать этикетки доставки и отправить образцы. Пользователи должны организовать доставку с курьером, используя данные учетной записи ESRF. В день эксперимента образцы передаются в Массивный роса высокой емкости.
Затем ученые линии луча запускают сбор данных, за которым могут следить пользователи удаленно. Для каждого типа выборки пользователи получают электронное письмо, информирующее их о том, что сбор данных начался. Выполнение всех этапов во всех рабочих процессах можно следить онлайн и в режиме реального времени.
Это доступно для пользователя, войдя в ISPyB. Результаты также можно просматривать и загружать. Для каждого анализируемого образца изучите результаты автоматического эксперимента на ISPyB.
Нажмите на нужную экспериментальную сессию на ID30A1. Выберите предпочтительный конвейер автоматической обработки. Загрузите данные, написанные в правильной космической группе с высочайшей полнотой и высоким разрешением.
Нажав на последние результаты сбора, а затем скачать. Рабочий процесс MX press P использовался линией луча ESRF Massive, чтобы полностью автоматически монтировать, центр в рентгеновском луче, характеризовать и собирать полные наборы данных дифракции из серии кристаллов человека GCSH. Образцы были смонтированы и петля проанализирована для области для сканирования.
После дифракционных анализов для сбора данных в кристалле было выбрано четыре точки. Ручное определение структуры путем молекулярной замены дало карту плотности электронов высокого качества после одного автоматизированного цикла уточнения. Для этого набора данных автоматизированный конвейер вырезал данные в одной точке три два разрешения ангстрема.
Тем не менее, пользователи могут принять решение о сокращении данных в более низком разрешении. Непрерывная плотность электронов видна для всей аминокислотной цепи, кроме этерминального гистидина. Из четырех замен, которые отличают человека и крупного рогатого скота GCSH, три легко идентифицировать в плотности электронов.
Это менее ясно для аспарагиновой кислоты лизина 125 замены. Для которых плотность электрона боковой цепи только частично разрешена из-за гибкости. Полученная в настоящее время модель имеет значение R работы 20 точки четыре процента и R бесплатное значение 23 точки восемь процентов и может быть дополнительно оптимизирована за счет дополнительных циклов автоматизированного и ручного построения модели и уточнения.
Важно адаптировать требования к вашей системе. Например, установка уже наблюдаемого разрешения на известное значение может сэкономить время и обеспечить более эффективное сбор данных. Полностью автоматический сбор данных демократизировал кристаллографию, и теперь даже небольшие лаборатории могут приступить к знаменитому проекту, когда это было возможно раньше только с огромной силой человека.
Обзор
В данной статье описывается процесс автоматизированного скрининга и сбора данных на синхротронных линиях для белковой кристаллографии. Полностью автоматизированная система позволяет исследователям эффективно собирать и обрабатывать данные образцов, охлажденных криогенным способом, без участия человека.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Кристаллография белков
- Рентгеновская дифракция
- Автоматизация сбора данных
Теоретические сведения
- Рентгеновская кристаллография имеет определяющее значение для установления структур белков.
- Линии синхротронного излучения имеют решающее значение для получения данных от слабодифрагирующих кристаллов.
- Автоматизация повышает эффективность и качество сбора данных.
- Массивная линия излучения обеспечивает полностью автоматизированный рабочий процесс для биологических макромолекул.
Цель исследования
- Продемонстрировать процесс автоматизированного сбора данных на синхротронных линиях.
- Осветить преимущества автоматизации в кристаллографии белков.
- Предоставить подробный протокол для использования исследователями.
Используемые методы
- Монтаж образцов и их транспортировка на синхротрон.
- Использование информационной системы ISPyB для управления экспериментом.
- Автоматизированные рабочие процессы сбора и обработки данных.
- Мониторинг сбора данных и анализ результатов в режиме реального времени.
Основные результаты
- Успешный сбор высококачественных дифракционных данных кристаллов GCSH человека.
- Автоматизированная обработка позволила получить карту электронной плотности высокого разрешения.
- Выявлены структурные различия между GCSH человека и быка.
- Продемонстрирована эффективность автоматизированных рабочих процессов в кристаллографии.
Выводы
- Автоматизация сбора данных делает кристаллографию более доступной.
- Теперь небольшие лаборатории могут реализовывать сложные проекты, которые ранее были доступны только в крупных центрах.
- Подбор индивидуальных параметров эксперимента позволяет повысить эффективность сбора данных.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Полностью автоматизированные синхротронные линии позволяют сократить необходимость ручного вмешательства в макромолекулярной кристаллографии, обеспечивая возможность высокопроизводительного скрининга и сбора данных с кристаллов со слабым дифракционным рассеянием. Такая автоматизация повышает качество данных и пропускную способность, позволяя научно-исследовательским группам биофармацевтических компаний сосредоточить усилия на валидации мишеней и оптимизации соединений-лидеров, а не на эксплуатации самой линии. Эта технология делает структурную биологию более доступной, способствуя снижению рисков на ранних этапах разработки терапевтических мишеней за счет получения надежных данных о трехмерной структуре.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, предоставляя структурные данные высокого разрешения о биологических макромолекулах.
- Операционная ценность: способствует функциональной валидации мишеней за счет автоматизированного анализа и сбора данных в ходе экспериментов по кристаллизации.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность моделей мишеней, обеспечивая получение стабильных, высококачественных карт электронной плотности для направленного структурой дизайна.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных кристаллических систем для последующих этапов работы путем автоматизации монтажа, центрирования и дифракционного анализа.
- Операционная ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа с помощью предопределенных рабочих процессов и мониторинга в реальном времени через ISPyB.
- Масштабируемость: Возможность скрининга большого количества кристаллов и повторного использования автоматизированных конвейеров в различных проектах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: связывает структурные данные этапа открытия с доклинической валидацией, предоставляя надежные модели для изучения механизмов действия.
- Прогресс с учетом рисков: поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем выявления структурных различий между вариантами разных видов, например, GCSH человека и быка.
- Снижение механистических рисков: уточняет сайты связывания и гибкость молекул, помогая в интерпретации взаимосвязи «структура — активность».
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Автоматизированная линия пучка интегрирована в непрерывный процесс поиска — от ранней валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, обеспечивая получение данных для последующего анализа и моделирования.
- Биологические исследования: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем решения структур кристаллов белков и их комплексов.
- Скрининг: обеспечивает создание готовых к анализу систем с количественными выходными данными, такими как разрешение, полнота и кратность, для надежной оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет измеримые показатели, включая значения R-work и R-free, пределы разрешения и карты электронной плотности для сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: связывает структурные данные с доклинической преемственностью, позволяя уточнять видоспецифичные модели, что было продемонстрировано на примере GCSH.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многоразовая платформа для структурного скрининга по нескольким мишеням, снижая зависимость от узкоспециализированных экспертов на местах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности моделей мишеней, устранение механистической неопределенности и поддержка разработки лекарств на основе структуры.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость сбора данных по различным образцам и проектам.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала за счет сокращения персонала на линиях синхротронного излучения и снижение биологических рисков при отборе ведущих соединений.
- Влияние на портфель: Приоритизация мишеней с учетом рисков на основе показателей структурной достоверности и качества данных.
Рекомендации по реализации
- Для успешного монтажа и характеризации кристаллов требуется опыт в области белковой кристаллографии и подготовки образцов.
- Для автоматизированного сбора данных необходим доступ к синхротронным установкам и такому оборудованию, как линия Massive one.
- Стандартизация работы между группами требует согласованного использования ISPyB для отслеживания экспериментов, выбора рабочих процессов и извлечения результатов.
- Адаптация под различные модельные системы предполагает корректировку таких параметров, как пороги разрешения, пространственная группа и радиационная чувствительность, в зависимости от свойств кристаллов.
- Практические ограничения включают необходимость криоохлаждения образцов и зависимость от качества кристаллов, что влияет на эффективность автоматизированных рабочих процессов.
