Полностью автономные характеристика и сбора данных от кристаллов биологических макромолекул
March 22nd, 2019
Здесь мы опишем, как использовать автоматизированной проверки и параметры сбора данных доступны на некоторых Синхротронное излучение. Ученые отправить образцы cryocooled синхротрон, дифракционные свойства проверяются, наборы данных собираются и обрабатываются и, где это возможно, структура решения осуществляется — все это без вмешательства человека.
Рентгеновская кристаллография является доминирующим методом для определения 3D структурной информации из белков. Линии синхротронного луча необходимы для получения данных из небольших, слабо диффрактных кристаллов, которые производят белки. Массивная линия представляет собой уникальную линию луча, поскольку полностью автоматизирует процесс сбора данных с биологических макромолекул.
Из выборки монтажа, местоположения и окончательного сбора данных. Полная автоматизация такого рода очень важна, так как позволяет исследователям проводить время в лаборатории, а не собирать данные на линии луча. Линия луча также умна и в среднем может собирать лучшие данные, чем когда линия луча управляется людьми.
Чтобы начать этот протокол, выполните кристаллическое монтажное и запросите время луча на Massive, как описано в текстовом протоколе. Перейдите на информационную систему для белковых кристаллических лучей, или веб-сайт ISPyB. Выберите эксперименты MX, воймить с номером эксперимента и паролем.
Нажмите на отгрузку, добавьте новую и предоставьте необходимую информацию. Затем нажмите сохранить. Нажмите добавить посылку и заполнить запрашиваемую информацию.
Нажмите сохранить, а затем нажмите добавить контейнер. Дайте шайбе штрих-код в качестве имени, и выбрать позвоночник шайбу, снова нажмите сохранить. Нажмите на символ контейнера и редактировать, и заполнить необходимую информацию о образцах, таких как название белка, предпочтительный поток работы, и кристаллическое положение, в шайбе.
Выберите белок, одобренный группой безопасности ESRF. Введите уникальное имя образца для идентификации каждого отдельного образца. По желанию сканируйте штрих-код пин-кода.
Остальная часть информации, которую нужно включить, также необязательна. Для каждого отдельного образца введите тип эксперимента. Это определяет, какой автоматический рабочий процесс будет использоваться для обработки каждого кристалла.
Учитывая, что кристаллы GCSH являются иглами, выберите MX нажмите P.Next, введите космическую группу. При наличии этого средства они будут использоваться для расчетов стратегии сбора данных и автоматических линий обработки данных. Введите нужное разрешение.
Это определяет расстояние кристалла до детектора от первоначального сканирования сетки, характеристики и сбора данных по умолчанию. Теперь установите желаемое пороговое разрешение, чтобы предотвратить сбор полных наборов данных из кристаллов, которые не диффрактировать до этого предела. Это может сэкономить место для хранения данных и проанализировать время.
Установите требуемую полноту. Затем установите требуемую множественность. Если на поддержке образца содержится более одного кристалла, установите максимальное количество кристаллов, которые будут проанализированы.
Значение по умолчанию составляет один или пять для MX нажмите P.Соответствующий размер луча также может быть выбран. Поместите в космическую группу, если это известно, в столбец космической группы силы. Затем установите радиационную чувствительность кристаллов.
При желании установите общий угол вращения, который будет собран для полного сбора набора данных. После ввода всей информации в систему сохраните значения. Нажмите на кнопку, вернитесь к отгрузкам и нажмите отправить отгрузку в ESRF.
Печать этикетки доставки и отправить образцы. Пользователи должны организовать доставку с курьером, используя данные учетной записи ESRF. В день эксперимента образцы передаются в Массивный роса высокой емкости.
Затем ученые линии луча запускают сбор данных, за которым могут следить пользователи удаленно. Для каждого типа выборки пользователи получают электронное письмо, информирующее их о том, что сбор данных начался. Выполнение всех этапов во всех рабочих процессах можно следить онлайн и в режиме реального времени.
Это доступно для пользователя, войдя в ISPyB. Результаты также можно просматривать и загружать. Для каждого анализируемого образца изучите результаты автоматического эксперимента на ISPyB.
Нажмите на нужную экспериментальную сессию на ID30A1. Выберите предпочтительный конвейер автоматической обработки. Загрузите данные, написанные в правильной космической группе с высочайшей полнотой и высоким разрешением.
Нажав на последние результаты сбора, а затем скачать. Рабочий процесс MX press P использовался линией луча ESRF Massive, чтобы полностью автоматически монтировать, центр в рентгеновском луче, характеризовать и собирать полные наборы данных дифракции из серии кристаллов человека GCSH. Образцы были смонтированы и петля проанализирована для области для сканирования.
После дифракционных анализов для сбора данных в кристалле было выбрано четыре точки. Ручное определение структуры путем молекулярной замены дало карту плотности электронов высокого качества после одного автоматизированного цикла уточнения. Для этого набора данных автоматизированный конвейер вырезал данные в одной точке три два разрешения ангстрема.
Тем не менее, пользователи могут принять решение о сокращении данных в более низком разрешении. Непрерывная плотность электронов видна для всей аминокислотной цепи, кроме этерминального гистидина. Из четырех замен, которые отличают человека и крупного рогатого скота GCSH, три легко идентифицировать в плотности электронов.
Это менее ясно для аспарагиновой кислоты лизина 125 замены. Для которых плотность электрона боковой цепи только частично разрешена из-за гибкости. Полученная в настоящее время модель имеет значение R работы 20 точки четыре процента и R бесплатное значение 23 точки восемь процентов и может быть дополнительно оптимизирована за счет дополнительных циклов автоматизированного и ручного построения модели и уточнения.
Важно адаптировать требования к вашей системе. Например, установка уже наблюдаемого разрешения на известное значение может сэкономить время и обеспечить более эффективное сбор данных. Полностью автоматический сбор данных демократизировал кристаллографию, и теперь даже небольшие лаборатории могут приступить к знаменитому проекту, когда это было возможно раньше только с огромной силой человека.
Обзор
Эта статья описывает автоматизированный процесс скрининга и сбора данных на синхротронных линях для рентгеноструктурного анализа белков. Полностью автоматизированная система позволяет исследователям эффективно собирать и обрабатывать данные из криоохлажденных образцов без участия человека.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Рентгеноструктурный анализ белков
- Рентгеновская дифракция
- Автоматизация в сборе данных
Бэкграунд
- Рентгеноструктурный анализ необходим для определения структур белков.
- Синхротронные линии имеют решающее значение для получения данных из слабодифрагирующих кристаллов.
- Автоматизация повышает эффективность и качество сбора данных.
- Massive one beamline предлагает полностью автоматизированный рабочий процесс для биологических макромолекул.
Цель исследования
- Продемонстрировать автоматизированный процесс сбора данных на синхротронных линиях.
- Выделить преимущества автоматизации в рентгеноструктурном анализе белков.
- Предоставить подробный протокол для исследователей.
Используемые методы
- Монтаж образца и его отправка на синхротрон.
- Использование информационной системы ISPyB для управления экспериментом.
- Автоматизированные рабочие процессы сбора и обработки данных.
- Мониторинг сбора данных в реальном времени и анализ результатов.
Основные результаты
- Успешный сбор высококачественных дифракционных данных из кристаллов человеческого GCSH.
- Автоматическая обработка дала карту электронной плотности с высоким разрешением.
- Выявлены структурные различия между человеческим и бычьим GCSH.
- Доказана эффективность автоматизированных рабочих процессов в рентгеноструктурном анализе.
Выводы
- Автоматизация в сборе данных демократизирует доступ к рентгеноструктурному анализу.
- Меньшие лаборатории теперь могут осуществлять сложные проекты, ранее ограниченные большими учреждениями.
- Настройка экспериментальных параметров может повысить эффективность сбора данных.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Fully automated synchrotron beamlines reduce manual intervention in macromolecular crystallography, enabling high-throughput screening and data collection from weakly diffracting crystals. This automation enhances data quality and throughput, allowing biopharma R&D teams to allocate scientific effort toward target validation and lead optimization rather than beamline operations. The technology democratizes access to structural biology, supporting early-stage de-risking of therapeutic targets through reliable 3D structural insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing high-resolution structural data on biological macromolecules.
- Operational Value: Supports functional target validation through automated characterization and data collection from crystallization trials.
- Predictive Value: Increases confidence in target models by delivering consistent, high-quality electron density maps for structure-guided design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated crystal systems for downstream workflows by automating mounting, centering, and diffraction analysis.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via predefined workflows and real-time monitoring through ISPyB.
- Scalability: Enables screening of large numbers of crystals and reuse of automated pipelines across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural data to preclinical validation by providing reliable models for mechanistic studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying structural differences between species variants, such as human and bovine GCSH.
- Mechanistic De-risking: Clarifies binding sites and flexibility, aiding in the interpretation of structure-activity relationships.
Pipeline & Workflow Integration
The automated beamline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting data generation for downstream analytics and modeling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by solving crystal structures of proteins and complexes.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs such as resolution, completeness, and multiplicity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts including R-work and R-free values, resolution cutoffs, and electron density maps to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural insights to preclinical continuity by enabling species-specific model refinement, as demonstrated with GCSH.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing dependency on site-specific expertise.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target models, reduction of mechanistic ambiguity, and support for structure-based drug design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data collection across samples and projects.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through reduced beamline staffing, and lowered biological risk in lead selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and data quality metrics.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallography and sample preparation is required for successful crystal mounting and characterization.
- Access to synchrotron facilities and instrumentation such as the Massive one beamline is essential for automated data collection.
- Standardization across teams requires consistent use of ISPyB for experiment tracking, workflow selection, and result retrieval.
- Adaptation across model systems involves adjusting parameters such as resolution thresholds, space group, and radiation sensitivity based on crystal properties.
- Practical limitations include the need for cryocooled samples and dependency on crystal quality, which affects automated workflow success rates.
