Применение передовых в Vitro культивирования технологии для изучения человеческого кишка микробиоты

Целью этого протокола является культура микрофлоры кишечника в пробирке. Это позволит изучать динамику микробиоты без необходимости учитывать вклад современной составляющей. Используя эту многоступенчатую систему in vitro, мы считаем, что сообщество микробиоты развивается в люминесценте и на слизистой оболочке многослойной толстой кишки можно начать одновременно.

Визуальная демонстрация этого метода полезна из-за сложности этой системы in vitro. Начните с заполнения восходящей толстой кишки с 500 миллилитров определенной среды, поперечной толстой кишки с 800 миллилитров определенной среды, и нисходящей толстой кишки с 600 миллилитров определенной среды. Добавить муцин agricarriers в области толстой кишки в размере, пропорциональном объему реактора, и использовать образец трубки и шприца, чтобы удалить излишки определенных среды из каждого реактора.

Используйте рН зонды для регулировки рН в каждом реакторе. И включите азотный флеш в течение 20 минут. Далее, оттепель фекальный гомогенат в соответствии с руководящими принципами производителя перед загрузкой 60 миллилитров шприц с фекальным гомогенатом образца.

Затем, привить каждый реактор толстой кишки через образец порта с количеством гомогената равна 5% от каждого объема реактора для ночной культуры с контролем рН. На следующее утро, очистить luer замок на образец порта каждого биореактора с алкоголем. Когда порты высохнет, подключите 30 миллилитров шприц, очищенный от всего воздуха, к одному из образцов портов.

Свяйте поршень три-пять раз, чтобы обеспечить тщательное смешивание компонентов сосуда перед аспирации 15 миллилитров суперната культуры из биореактора. Затем перенесите светящийся образец в стерильную трубку Falcon и поместите на лед. Для анализа ДНК соберите от одного до трех миллилитров светимой жидкости с помощью пяти миллилитрового шприца.

Соберите супернатную форму других биореакторов таким же образом. Чтобы выделить образец материала для анализа короткой цепи жирных кислот, центрифуга 15 миллилитров светимого образца интереса, и шприц фильтр супернат через 0,2 микрометра поры фильтр для минус 80 градусов по Цельсию хранения. Чтобы выделить образец материала для анализа ДНК, центрифуга один миллилитр светимой жидкости и хранить гранулы при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Для сбора мукосалового образца удалите подготовленные носители муцина с четырех градусов по Цельсию и включите азотный флеш. Быстро откройте крышку реактора и замените 50% носителей в каждом реакторе новыми. Когда все носители были заменены, быстро запечатать крышку и поддерживать азот флеш еще 20 минут.

Затем aliquot от 0,25 до 0,5 граммов муцина перевозчика агар в отдельных двух миллилитров труб для минус 80 градусов по Цельсию хранения до извлечения ДНК. Три раза в день система автоматически циклов. Это начинается с 140 миллилитров определенной среды, переданной в биореактор желудка, а затем один час инкубации с контролем рН.

В конце инкубации содержимое желудка передается в тонкий кишечник вместе с 60 миллилитров сока поджелудочной железы. В биореакторе тонкой кишки рН автоматически регулируется до 6,7-6,9, а содержимое инкубируется в течение 90 минут. Во время этой инкубации азотный флеш для каждой системы включен в общей сложности 10 минут.

В конце этого инкубации содержимое тонкой кишки передается в восходящую толстую кишку, из восходящей толстой кишки в поперечную толстую кишку, из поперечной толстой кишки в нисходящую толстую кишку и из нисходящей толстой кишки в отходы. В этом репрезентативном основном анализе координат сообщество как ни в чем не изменилось в течение одного-семи дней. Однако с 11-го дня после прививки до окончания эксперимента образцы занимали небольшую область основного пространства анализа координат для выборки для выборки баллов расстояния на основе оперативной таксономической единицы, наличия отсутствия и изобилия.

Измерение трех известных короткокоголовых жирных кислот показывает, что пропионовая кислота, бутаноевая кислота и уксусная кислота колеблются с начала эксперимента до 15-го дня после прививки. После 15-го дня количество этих кислот, вырабатываемых в каждой области толстой кишки, оставалось неизменным с минимальными изменениями до конца эксперимента. Анализ стабильного сообщества для светимой и слизистой фазы каждой области толстой кишки показывает, что общины, которые развиваются в отдельных областях толстой кишки системы in vitro похожи на фекальный инокульный состав.

Сравнение альфа-разнообразия системы in vitro показывает тот же уровень разнообразия, что инокулум для всех регионов, за исключением светящихся образцов из восходящей области. Демонстрация того, что система культуры in vitro способна создать сообщество, сравнимое с фекальным инокулем как по составу, так и по разнообразию. Для создания стабильного сообщества микрофлоцитов кишечника с помощью этого протокола крайне важно обеспечить точную готовность решений и соблюдение анеробных условий и параметров рН на протяжении всего эксперимента.

После этой процедуры, образцы могут быть проанализированы для состава сообщества с помощью следующего поколения секвенирования ДНК с последующим биоинформатическим анализом и для функциональности с использованием метаболомики.