Метод микроэлектрода Impalement для записи Мембраны Потенциал из канналедированной средней мозговой артерии

Этот протокол может быть использован для измерения мембранного потенциала нормальных и больных кровеносных сосудов и для оценки фармакологических агентов, которые модулируют мембранный потенциал, сосудистый тон и кровоток. Мембранные потенциалы, генерируемые этой техникой, близки к физиологическому диапазону, так как сосудистые гладкие мышцы в сосуде находятся в синцитиуме. Перед началом процедуры поместите в нужное место двухканально-дифференциальный электрометровый усилитель рядом с камерой сосуда.

Используйте кабель BNC-BNC для подключения вывода канала усилителя A или B к входу канала дигитайзера. Намонтировать зонд в микроманипуляторе и повернуть микроманипулятор к микроскопу и миографу на безвкусный стол. Поместите ручки и переключатели на передней части усилителя в соответствующих положениях для эксперимента, как описано в руководстве.

Затем соедините основание ванны с кольцевой площадкой усилителя соответствующим электродом и убедитесь, что клетка заземлена на шасси усилителя. Для подготовки борозиликатных стеклянных микроэлектродов используйте стандартный шкив для достижения короткого, постепенного, 8-10-миллиметрового конуса диаметром менее одного микрометра, дважды петляя для более высоких сопротивлений и меньших кончиков. Используйте микроволокна шприц для заполнения микроэлектрода с трех-молярного хлорида калия, медленно убирая поршень во время инъекции, чтобы пространство для жидкости, чтобы заполнить и предотвратить образование пузырьков внутри микроэлектрода.

Поместите полностью загруженный микроэлектрод на держатель микроэлектрода и осторожно, но твердо натолкнете хвостовик электрода в держатель через скучное отверстие. Удалите излишки жидкости с лабораторной ткани, и подключить сборку держателя электрода к зонду усилителя. Проведи электродный тест для измерения сопротивления электрода.

Затем откройте программное обеспечение для записи, назначьте имя файлу и сохраните файл для будущего анализа. Затем промыть миографическую камеру дистиллированной водой несколько раз перед загрузкой камеры пятью миллилитров нормального физиологического соленого раствора, или PSS. Используя пяти- или 10-миллилитровый шприц, заполните как стеклянные канюли, так и прикрепленные трубки с фильтрованной нормальной PSS без введения пузырьков воздуха, и используйте тупые миппы, чтобы сделать половину узла в двух 10-0 монофиламентных нейлоновых швов.

Затем, используя миппы вскрытия под микроскопом вскрытия, поместите частично закрытые швы узлов на обоих канюли немного от кончиков. Для изоляции средних мозговых артерий используйте пружинные ножницы и типсы для выявления и вскрытия небранного сегмента средней мозговой артерии, с внутренним диаметром от 100 до 200 микрометров, крысиного мозга. Используйте тонкие щипцы, чтобы смонтировать среднюю мозговую артерию на стеклянные канюли, и затянуть швы, чтобы обеспечить артерию к канюле.

Закройте дистальную канюлю так, чтобы не было потока внутри артерии, и соедините приток пипетки с резервуаром PSS. Визуализуйте каннулированную среднюю мозговую артерию с помощью камеры, сочетаемой с зарядом, установленной на перевернутом микроскопе и программном обеспечении для визуализации. Установите осью длину MCA до приблизительной длины так, чтобы она не очелась ни жесткой, ни вялой.

Эквилибрировать раствор ванны с 95%кислородом и 5%углекислым газом при 37 градусах Цельсия. Погрузите землю усилителя в PSS моегоографа. Осветите камеру сосуда и визуализируете кончик микроэлектрода в растворе ванны через микроскоп.

Используя микроманипулятор, перемести кончик микроэлектрода близко к внешней стенке кровеносных сосудов и начните запись. Медленно двигайтесь кончиком микроэлектрода к сосуду, стремясь к центру судна. Когда кончик приходит в непосредственной близости от сосуда, заранее электрод вперед в одном быстром движении, чтобы проколоть мембрану мышцы.

После того, как мембрана была прорезала, изменения в мембранном потенциале могут наблюдаться. Не прикасайтесь к микроманипулятору после прокола мембраны. Когда мембранные потенциальные изменения были записаны, используйте манипулятор, чтобы удалить микроэлектрод в одном быстром движении, и остановить запись перед сохранением файлов данных.

Импалмент считается успешным, когда происходит быстрое отклонение к отрицательным значениям, мембранный потенциал стабилен в течение как минимум 30 секунд, а напряжение резко возвращается к нулю милливольт при удалении электрода. После успешной стабилизации impalement и мембранного потенциала, препараты, представляющие интерес, могут быть проникнуты в ванну и изменения в мембранном потенциале могут быть записаны. В этом репрезентативном эксперименте перфузия хлоридом калия деполяризировала мембрану примерно на шесть милливольт, в то время как перфузия с кальциезависимым активатором больших проводящих кальциевых калийных каналов гиперполяризировала мембрану почти на четыре милливольта.

Самое главное помнить, чтобы вытащить высокоустойчивых микроэлектродов, которые имеют короткий, постепенный конус с менее чем один микрометр диаметром.