Улучшение экструзии высокой вязкости микрокристаллов для времени решены серийный Фемтосекундный кристаллографии в рентгеновских лазеров

Этот протокол был разработан для того, чтобы проблемы, часто встречаемые во время серийных кристаллографических экспериментов, не скомпрометировали качество данных. Одним из основных преимуществ этого метода является его адаптивность к отдельным кристаллическим системам. Высокоскоростной экструзио-тест камеры также позволяет нам непосредственно измерять стабильность экструзии.

Во-первых, загрузите 50 микролитров кристаллообразного монолеина на основе LCP в 100 микролитровый шприц примерно за 30 минут до инъекции. Для инъекций в вакуумную среду загрузите пять микролитров MAG 7.9 и пять микролитров жидкого парафина в заднюю часть второго шприца. Держа шприц вертикально, изгнать пузырьки воздуха из шприца.

Соедините шприц с MAG 7.9 и парафином со стандартным парой шприцев. И очистить воздух от пары, осторожно нажав на поршень, пока небольшой объем смеси не будет виден на кончике иглы парпера. Подключите образец шприца к шприцу, который берет машину, чтобы не вводить воздух в образец.

Смешайте в липид и парафин, передавая образец через пару несколько раз. Затем загрузите 20 микролитров предварительно смешанного LCP в еще 100 микролитровых шприцев. Удалите пустой шприц из парпера и прикрепите предварительно смешанный LCP к кристаллу, содержащем шприц, используя стандартный парой шприцев.

Затем, передать образец через пару 100 раз. Чтобы довести образец до кубической фазы, добавьте три микролитров монооляина и смешайте 50 раз. Повторите эту процедуру только до тех пор, пока не сформит прозрачную фазу, чтобы избежать избытка монооляина.

В качестве предварительного теста на прочность образца и экструдируемость, отсоединить пустой шприц от шприца парпер, и проведение шприц вертикально, сжать небольшое количество пробоя через парпер. Если экструдированная проба образует вертикальный цилиндр, то образец готов к экструзио-тестированию. Отрегулируйте общий объем выборки до 100 микролитров, добавив больше предварительно смешанных LCP.

Прикрепите образец шприца и два пустых шприца к тройке шприца. Смешайте по крайней мере 50 раз, передав половину образца во второй шприц, а затем нажав обе половинки образца в третий шприц одновременно. Поместите шприц, содержащий смешанный образец, под стерео микроскопом, чтобы проверить однородное распределение кристаллов.

Очистить насос HPLC и все линии водоснабжения, чтобы обеспечить точность тарифов потока. Затем прочистим гидравлическую стадию инжектора. Затем включите и подключите камеру к поставляемому программному обеспечению.

С живым видео работает для визуальной обратной связи, положение сопла кончик в центре кадра и привести его в фокус с трехосевой стадии. Установите частоту кадров на камеру до 1000 кадров в секунду. Затем установите разрешение до 512 на 512 пикселей.

Теперь, когда время экспозиции устанавливается частотой кадров, отрегулируйте уровень освещенности до тех пор, пока сопло не будет видно. Перепозиционировать кончик сопла так, чтобы он по центру слева направо и расположен в верхней трети кадра. Настройка камеры в режиме промежуток времени.

Установите интервал до 30 секунд и повторы до 40 раз. Установите режим триггера случайным образом. И введите количество кадров для записи до 1000.

Теперь загрузите резервуар 20 микролитров испытательного образца и прикрепите сопло капилляров. Прикрепите заполненный резервуар к инжектору. Затем прикрепите газовую линию к порту на сопло и запустите поток газа.

После этого одновременно запустите насос и запись камеры. Мониторинг экструзии до тех пор, пока давление насоса резко не возрастет в течение ожидаемого времени окончания. Затем прекратите запись, выключите насос и вывечь давление системы, открыв клапан рельефа.

После этого откройте видеоф файл с помощью программного обеспечения для анализа и откалибровайте измерительные инструменты. Найдите кадр в видео, где есть отслеживаемая функция, видимая в экструзии. Завехай номер кадра.

Затем переветь видео в кадр, где та же функция видна, но перешла из своего положения на предыдущем этапе. Завехай номер кадра. Используя инструмент измерения прямой линии, измерьте расстояние от начала и точки конца объекта с помощью измерения анализа.

Повторите предыдущие шаги несколько раз для каждого сегмента видео. Наконец, сюжет серии данных. Идеальным стартовым материалом для описанной здесь процедуры является высокая плотность микрокристалл, включенных в вязкую носительную среду для инжектора.

Кристаллы белка были использованы для сбора данных TRSFX о протонной перекачиваемой бактерии родопсин, который показал ультра быстрые изменения, которые происходят после поглощения фотона. После подготовки образца с использованием трехмерного парпера, визуальный осмотр материала в шприце показывает однородность образца. А изображения микроскопа могут подтвердить плотность кристаллов.

Образец находится в кубической фазе, когда среда доставки ясна и вязкая. Turbid смеси являются признаком того, что образец находится в губке или ламеллярд фазы, но не являются окончательными, как высокая плотность кристалла может скрыть ясность LCP. Тест низкого давления для определения фазы губки может быть выполнен путем вытягивания поршеня шприца от образца.

Во время испытания струи, образец должен выдавить длинный непрерывный столбец LCP, который движется с почти постоянной скоростью. Образцы, которые работают в режиме капель, указывают на то, что вязкость слишком низка. Данные из образцов, которые образуют столбец, должны показать, что экструзия остается выше минимальной скорости, продиктованной экспериментальными параметрами.

После оптимизации с помощью этого протокола разрешение времени серийные кристаллографические данные могут быть собраны в экспертном центре. Это покажет конформациальные изменения в всем белке по мере того как оно выполняет свою функцию.