Индукция и скоринг трансплантата-Versus-Host болезни в Xenogeneic Murine модели и количественной оценки человеческих Т-клеток в мышь тканей с помощью цифровых ПЦР

В этом протоколе описывается, как вызвать ксенотрансплантат против принимающей болезни, или xenoGVHD, и как ослепить и стандартизировать клинический скоринг для обеспечения последовательных результатов. Модель xenoGVHD обеспечивает in vivo метод для тестирования иммуносупрессивной терапии против человека, а не murine T-клеток, улучшение перевода этих исследований в клинику. Демонстрацией процедуры будет Амара Сенг, аспирантка моей лаборатории.

За день до инъекции, место от восьми до 12 недель, не ожирением диабетической scid гамма, или NSG, мышей в стерилизованной клетке пирога, и облучать мышей в цезий-137 источник с общей дозой 150 centigrays, с медленным вращением, чтобы обеспечить равномерное облучение. Затем поместите мышей в чистые клетки в стерильный шкаф биобезопасности на ночь. На следующее утро, собрать достаточно здоровой человеческой крови, чтобы изолировать 1,1 раза 10 до семи периферических моноядерных клеток крови, или ПХМВ, на мышь, и разбавить гепаринизированной крови в равном объеме 2%фетальной сыворотки крупного рогатого скота, или FBS, в PBS.

Тщательно наложить до 25 миллилитров разбавленной крови на 15 миллилитров градиента плотности разделения лимфоцитов в 50-миллилитровой конической трубке для центрифугации градиента плотности. В конце разделения, урожай PBMC на интерфейсе, и мыть клетки в 10 миллилитров PBS в новой 50-миллилитровой конической трубки. Аспирировать супернатант, и Флик трубки, чтобы ослабить гранулы.

Повторное распределение ПБМК в 10 миллилитров свежего PBS для другой центрифугации, а затем повторное успение в пяти миллилитров свежих PBS для подсчета. Затем соберите клетки с окончательной центрифугации, и повторно гранулы в один раз от 10 до восьми PBMCs на миллилитр концентрации PBS. Для ретро-орбитальной доставки изолированного человеческого PBMC в глаз мыши загрузите один одноми миллилитровый шприц, оснащенный иглой 28-го калибра со 100 микролитров клеток.

Подтвердите отсутствие ответа на палец щепотку, и осторожно удерживайте мышь большим и средним пальцем. Вставьте иглу скошенной стороны вниз, боковой в медиальной canthus, через конъюнктивальной мембраны до тех пор, пока задняя часть глаза не будет достигнута. Слегка втягиваем иглу и медленно вводим весь объем клеток.

Затем полностью убираем иглу для правильного удаления шприца и иглы. Закройте веко и нанесите мягкое давление на место инъекции марлевой губкой. Затем осмотрите место инъекции на отек или другие видимые травмы, и позвольте мыши, чтобы восстановить сознание в стерильной клетке выстроились с бумажными полотенцами и мониторинга перед перемещением животного в свою домашнюю клетку.

Чтобы измерить счет GVHD, поместите клетку в капот ламинарного потока, и удалить пищу и воду из клетки. Чтобы забить активность, наблюдайте за поведением мышей в течение пяти минут. Чтобы получить оценку потери веса, взвесить каждую мышь в стакане.

В то время как мышь все еще находится в стакане, осмотрите животное на осанку, текстуру меха и целостность кожи. После сбора процентных тканей, вырезать примерно три на 0,5-миллиметровый кусок ткани из органа, и взвесить образец на балансе. Перенесите взвешенную ткань в стерильную 1,5-миллилитровую трубку и заморозьте образец в жидком азоте для ночного хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

На следующее утро, оттепель образцов до лиза, в соответствии с инструкциями из геномной изоляции ДНК комплекта. Для количественной оценки Т-клеток человека цифровой полимеразной цепной реакцией, или ПЦР, подготовьте цифровые реакции ПЦР в соответствии с протоколом для ДНК связывающих красителей для используемой цифровой машины ПЦР и используя соответствующие грунтовки для геномной ДНК человека CD3 epsilon. Затем провести цифровую реакцию ПЦР в соответствующих условиях реакции.

Sublethally облученных от восьми до 12-недельного NSG мышей обоих полов, которые получают человека PBMC начинают показывать клинические признаки GVHD около дня 10 после инъекции по сравнению с отрицательным контролем мышей лечение только PBS. Мышей XenoGVHD имеют медианную выживаемость 23,5 дней. Используя цифровой ПЦР, CD3 эпсилон-положительные человеческие Т-клетки могут быть обнаружены в легких и печени образцов мышей, которые получают человеческие ПКМТ.

Очень важно, чтобы скоринг выполняется последовательно, и что исследователь забил мышей ослеплен их лечения. После этой процедуры сыворотку можно собирать у эвтанизированных мышей для анализа экспрессии периферических цитокинов, а иммунные клетки могут быть собраны из селезенки для анализа с помощью цитометрии потока.