Флуоресцентная визуализация Манго помечены РНК в полиакриламида гели с помощью пост-стоиносидный метод

Манго помечены гель визуализации методологии продемонстрированы здесь является надежным и, как ожидается, будет в состоянии быть просто продлен с точки зрения чувствительности и специфичности. Это еще больше упростило бы рутинную очистку биологически важных РНК и РНК-комплексов путем простого целесообразности добавления манго-тега в РНК, представляющие интерес. РНК в настоящее время вовлечены во все больше и больше заболеваний для этого поста знакомства метод простой и быстрый способ, чтобы иметь возможность отслеживать и визуализировать РНК.

Дополнительная осторожность будет необходимо в передаче гель из одного места в другое, как гели хрупкие и склонны к нарушению. Чтобы подготовить 30 миллилитров денатурации гель, сначала выберите полиакриламид процент с соответствующим бромофенол синий, и ксилен цианол красителей по сравнению с РНК интерес для обеспечения разделения высокой полосы. Затем смешайте решения A, B и C в соответствии с таблицей 1 и добавьте APS и timud.

Немедленно вылейте гель раствор в соответствующий гель литья аппарата. Вставьте желаемый конус и оставьте гель полимеразе примерно на 30 минут. Составляют гель танк с помощью 1 XTBE решение и тщательно удалить конус.

Аккуратно поднимите гель и смонтировать на гель аппарата и обеспечить с помощью связующих клипов. Используя шприц, аспирировать скважины непосредственно перед загрузкой образца. Подготовь 1X РНК образцов, добавив 2X денатурации гель загрузки решение РНК образцов, представляющих интерес.

Используйте термоциклер для нагрева образцов при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Затем загрузите охлажденные образцы на дно каждой хорошо с помощью гель загрузки советы. И хорошо гель при комнатной температуре обеспечения власти эффективно низким, чтобы не взломать стеклянную пластину гель аппарата.

Подготовка 1X гель окрашивания решение в соответствии с рукописью в чистом стеклянном контейнере, который достаточно широк, чтобы удобно соответствовать гель. Добавьте достаточное количество раствора для окрашивания геля 1X в контейнер, чтобы гель был полностью покрыт раствором при размещении на орбитальном ротаторе. После того, как гель заканчивается работает, удалить гель из аппарата, отрезать its'wells, и угол геля, с тем чтобы помочь определить ориентацию.

Затем осторожно перенесите гель в раствор окрашивания геля 1X. Для выполнения изображения, тщательно decant окрашивания раствора и промыть гель быстро с водой. Наконец, осторожно перенесите гель на лоток, который будет помещен в изображение.

Roll стеклянный пипетка над гелем, чтобы удалить захваченных пузырьков и избыточной жидкости. И приступить к принятию гель изображения. Манго aptamers один, два, три, четыре были существенно сопротивляться денатурации примерно до одной концентрации молярной мочевины.

20 до 40 минут окрашивания времени было достаточно для максимального геля florescence. Более длительное время не подходит для небольших РНК, используемых в этом исследовании, как они начали распространяться из геля. Флюорометр анализ показал, что манго aptamers один, два и три в присутствии мочевины может раз быстрее, чем aptamer четыре.

В отсутствие мочевины, складывание было гораздо быстрее, как ожидалось. Чувствительность метода пост-окрашивания была показана одиночными полосами, соответствующими хорошо сложенным РНК для каждого из вариантов манго в родных и денатурированных гелях с немного меньшей чувствительностью для более поздних. Количественная оценка местных гелей была линейной журнала примерно на один порядок величины с Манго один, два и четыре ведут себя более линейно, чем манго три.

Количественная оценка денатурации гелей были более линейными, предполагая, что наличие мочевины в денатурации гель может обеспечить более однородный способ сложить aptamers, как только они помещены в TO1 биотин окрашивания решения. Манго помечены РНК могут быть обнаружены в присутствии общей РНК с помощью TO1 биотин окрашивания по сравнению с SG окрашивания. Не забудьте убедиться, что гель окрашивания контейнер достаточно велик, чтобы соответствовать гель в противном случае гель может сложить на себя.

Образцы РНК будут передаваться из одного места в другое. Подобно денатурации гелей, этот метод может быть выполнен для родного геля. Вы запустите гель в холодной комнате при более низкой мощности для поддержания родных условий.