Отдельные лист ассы для упрощения исследования экспрессии генов в картофель во время заражения жевательного насекомого Manduca sexta
15 мая 2019 г.
Представленный метод создает естественные травоядные поврежденные ткани растений путем применения личинок Manduca sexta к отдельным листьям картофеля. Ткань завода is assayed для выражения 6 homologs фактора транскрипции, включинных в предыдущих реакциях к травоядной насекомой.
Этот протокол использует обтекаемый подход для измерения экспрессии генов растений в ответ на травоядное насекомое. С помощью отдельных листьев, изолированных в чашках Петри, насекомые легче применять и контролировать в течение относительно короткого периода заражения способствует воспроизводимых данных экспрессии генов. Этот протокол может быть адаптирован к многим взаимодействиям растений и насекомых.
если учитывать базовые наблюдения из целых систем завода. Непредсказуемый характер кормления насекомыми может быть сложной задачей. Таким образом, надежный запас правильно постановочных личинок и здоровых растений обеспечивает наилучшие шансы на успех.
Визуализация того, как должны выглядеть и вести себя здоровые растения и насекомые, играет важную роль в достижении оптимальных результатов, особенно для исследователей, новых в области исследований. Демонстрация процедуры со мной будет Фрэнсис Перес, молекулярный биолог в генетическом улучшении фруктов и овощей лаборатории. Для приготовления узловой размножаемой ткани культуры картофельных растений, сначала получить Kennebec растения, выращенные из экза растительного материала, по крайней мере три-четыре узла.
Используйте стерильное лезвие, чтобы удалить листья резки ветви близко к основной стебель и оставив около двух миллиметров ветви ткани на лист. Вырезать примерно два миллиметра выше и ниже каждого узла, чтобы удалить узел разделы из стеблей и организовать узел черется в стерильной ткани культуры сосуд, содержащий узел передачи среды с ветвью указывая вверх. Затем перенесите нордные чере переноса в культурную камеру растительной ткани на две-три недели роста при 24 градусах По Цельсию и 16-часовой световой, восьмичасовой темный фото период.
Чтобы подготовить насекомых к кормлению, получить желаемую личиночковую стадию M.sexta и перенести по одной личинке в каждую колодец соответствующего сосуда в зависимости от размера личинки. Сделайте шаблоны размещения для каждой точки времени сбора урожая, используя пять крепких подносов, способных держать набор из шести надлежащим размером с чашки Петри, облицованные белой бумагой. Отслеживайте набор из шести кругов, используя чашку Петри соответствующего размера на бумаге в каждом подносе и наклейте на этикетку один набор кругов управления A, B и C, а другой зараженный A, B и C.Then обозначит каждый шаблон размещения соответствующим временем сбора урожая.
Далее, этикетка один 1,7 миллилитров микроцентрифуг трубки для каждого круга в шаблоне размещения, чтобы надлежащим образом определить возмущение, письмо репликации растений и точки времени сбора урожая. Когда все трубки были помечены, поместите стерильный бумажный диск фильтра в одну чашку Петри на шаблон и смочить диски стерильной водой, не давая избыток жидкого бассейна в каждом блюде. Затем поместите одно блюдо в каждый круг в каждом шаблоне размещения и поместите три картофельных растения одного возраста и относительного размера рядом с каждым шаблоном размещения.
Чтобы инициировать заражение, используйте стерильные ножницы, чтобы удалить два верхних размера соответствует листья от каждого растения и место один лист в контрольной чашке Петри и один в зараженных Петри блюдо для каждого растения как можно быстрее. Когда все листья были помещены, используйте мягкие миппы касания для передачи по крайней мере одной личинки в каждое зараженное блюдо как можно быстрее и установить таймер для желаемого времени заражения. Наблюдайте за кормлением, чтобы убедиться, что все личинки едят, заменяя любые некормленные личинки по мере необходимости.
Удалите все личинки из всех листьев в конце времени заражения и начать таймер для сбора урожая. В конце каждой точки времени сбора урожая, передать каждый лист в соответствующую трубку и сразу же падение трубки в жидкий азот, чтобы заморозить образец листа перед хранением при температуре минус 80 градусов по Цельсию до изоляции РНК. Здоровые точно постановочные личинки должны начать кормление сразу после размещения на поверхности листа и кормление должно продолжаться в достаточно последовательной манере на протяжении всего периода времени заражения.
Личинка в нижней части этого листа не потребляется какой-либо растительный материал и является примером неудачного заражения. Эти листья были отделены от двухнедельного вандала размножаются растения культуры тканей и потребляется с разной скоростью и кормления стилей для каждого личинок этапе. На основе этих результатов были отобраны четвертые личинки instar для дальнейшей оценки повреждений листьев для более зрелых почвенных растений картофеля, которые более приближены к выращенным на поле картофельным растениям.
В этих исследованиях экспрессии генов, два новых C2H2 цинка палец транскрипции факторов, которые надежно реагируют на M.sexta травоядных были определены поддержку использования отдельных листьев для заражения анализов. Не забудьте использовать возраст и размер соответствующих листьев и правильно этап личинок для каждого эксперимента, как единообразие приводит к более воспроизводимых данных. Ткани листьев могут быть анализированы на стресс-индукционных реактивных видов кислорода и производных гормона ясмоновой кислоты.
Целый транскриптом, протеом, или микробиом исследования также могут быть выполнены на листовых тканях.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе используется упрощенный подход для измерения экспрессии генов растений в ответ на поедание насекомыми. Применяя личинок Manduca sexta к отделенным листьям картофеля, исследователи могут легко отслеживать влияние гербивории на экспрессию генов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология растений
- Взаимодействие насекомых и растений
- Анализ экспрессии генов
Теоретические сведения
- Поедание растений насекомыми оказывает значительное влияние на здоровье и развитие растений.
- Понимание реакций растений на воздействие травоядных насекомых имеет решающее значение для сельскохозяйственной практики.
- Традиционные методы изучения этих взаимодействий могут быть сложными и характеризоваться высокой вариативностью.
- Анализы с использованием отделенных листьев обеспечивают контролируемую среду для проведения экспериментов.
Цель исследования
- Разработать надежный метод оценки экспрессии генов растений в ответ на поедание насекомыми.
- Облегчить изучение различных взаимодействий между растениями и насекомыми.
- Повысить воспроизводимость данных об экспрессии генов.
Используемые методы
- Помещение личинок Manduca sexta на отделенные листья картофеля.
- Изоляция листьев в чашках Петри для контролируемого наблюдения.
- Мониторинг пищевого поведения насекомых в ходе анализа.
- Анализ экспрессии гомологов факторов транскрипции.
Основные результаты
- Успешное нанесение личинок приводит к измеримым изменениям в экспрессии генов.
- Был проведен анализ экспрессии шести гомологов факторов транскрипции.
- Данные подтверждают воспроизводимость и адаптивность метода.
- Полученные результаты способствуют пониманию реакций растений на поедание насекомыми.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежную основу для изучения реакций растений на поедание насекомыми.
- Метод может быть адаптирован для различных взаимодействий растений и насекомых при условии использования надлежащего контроля.
- В будущих исследованиях данный метод может быть использован для изучения более широких экологических последствий.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Анализы с использованием отделенных листьев снижают биологическую вариабельность в исследованиях взаимодействия растений и насекомых, что позволяет получать более воспроизводимые данные об экспрессии генов для валидации мишеней в сельскохозяйственной биотехнологии. Этот оптимизированный подход способствует механистическому снижению рисков при изучении путей ответа на поедание насекомыми за счет изоляции ранних событий передачи сигнала в контролируемой масштабируемой системе. Данный метод повышает прогностическую достоверность при идентификации факторов транскрипции и сигнальных узлов, имеющих значение для разработки признаков защиты сельскохозяйственных культур.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать транскрипционные ответы на повреждение насекомыми-фитофагами с грызущим ротовым аппаратом, что способствует функциональной валидации генов-кандидатов, таких как транскрипционные факторы с C2H2-цинковыми пальцами.
- Операционная ценность: Упрощает экспериментальный процесс за счет отделения листьев перед заражением, что снижает требования к площади и увеличивает пропускную способность при скрининге целевых объектов.
- Стратегическая ценность: Облегчает проверку гипотез о путях защиты растений, помогая определить приоритетные признаки для программ по улучшению сельскохозяйственных культур.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: предоставляет стандартизированную платформу для количественной оценки изменений экспрессии генов в ответ на определенные воздействия в результате поедания насекомыми.
- Практическая ценность: использование чашек Петри для содержания листьев обеспечивает воспроизводимость и облегчает мониторинг поведения личинок при питании.
- Стратегическая ценность: позволяет адаптировать метод для различных систем «растение-насекомое», что обеспечивает широкую применимость в программах по поиску агрохимикатов и изучению признаков.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить последующий анализ маркеров стресса, таких как активные формы кислорода и производные жасмоновой кислоты.
- Практическая ценность: Позволяет осуществлять профилирование всего транскриптома, протеома или микробиома тканей листа, улучшая интеграцию мультиомных данных при оценке признаков.
- Стратегическая ценность: Укрепляет трансляционную преемственность за счет установления связи между ранними реакциями экспрессии генов и фенотипическими результатами устойчивости к поеданию насекомыми.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Анализ отдельного листа относится к фазе поисковых биологических исследований, позволяя проводить тестирование гипотез на ранних стадиях и уточнять сигнальные пути перед переходом к идентификации ведущих кандидатов при разработке признаков сельскохозяйственных культур.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез о сигнальных путях, индуцированных фитофагией, и проясняет роль транскрипционных факторов в ранних защитных реакциях.
- Скрининг: обеспечивает готовность к анализу за счет стандартизированной подготовки листьев и контролируемых условий заражения, что гарантирует воспроизводимость количественных результатов.
- Аналитика: позволяет получать данные об экспрессии генов для сравнения условий заражения с контролем, что делает возможной статистическую оценку эффектов воздействия.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями, позволяя анализировать производные гормонов и маркеры окислительного стресса, связанные с фенотипической устойчивостью.
- Корпоративное повторное использование: служит многократно используемой платформой для изучения различных взаимодействий растений и насекомых, снижая затраты на повторную разработку в программах по поиску признаков.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения шума, вызванного вариабельностью всего растения, и фокусирования на автономной сигнализации в листе.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию и масштабируемость благодаря упрощенному отделению листа и формату анализа в чашках Петри.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки признаков, предоставляя надежные и воспроизводимые данные о ранних защитных реакциях.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию кандидатных генов с учетом рисков на основе стабильных паттернов экспрессии в ответ на повреждение насекомыми-фитофагами.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области культуры тканей растений, стадирования личинок и методов изоляции РНК.
- Необходимы стерильные инструменты, контролируемые камеры выращивания и инфраструктура для сохранения РНК (жидкий азот, хранилище при -80°C).
- Требуется межгрупповая стандартизация возраста и размера листьев, а также выбора возраста личинок для обеспечения единообразия эксперимента.
- При распространении метода на другие виды растений или насекомых-фитофагов с различным пищевым поведением необходимо учитывать особенности адаптации.
- Практические ограничения включают необходимость в здоровых личинках одного возраста и тщательный мониторинг для подтверждения стабильного питания на протяжении всего периода анализа.
