Подготовка биологический образец высокого давления замораживания, при содействии Микроволновая печь контрастности и минимальным смолы, встраивание образов тома
19 марта 2019 г.
Здесь мы представляем собой протокол для объединения двух методов обработки образца, высокого давления замораживания и образца при содействии микроволновой обработки, после чего минимальным смолы, встраивание для получения данных с целенаправленной ионного луча сканирующего электронного микроскопа (FIB-SEM). Это продемонстрировано с помощью мыши Большеберцовый нерв образца и Caenorhabditis elegans.
Этот метод подготовки образцов разработан, чтобы объединить лучшее качество сохранения ультраструктуры с наиболее подходящим контрастом для модальности изображения в сфокусированном ионной балке сканирующего электронного микроскопа. Этот протокол особенно полезен для образцов, которые требуют подготовки при замораживании высокого давления для надежного сохранения ультраструктуры, но не получают достаточного контраста во время замены замораживания объемной визуализации. Для минимального встраивания смолы важно удалить как можно больше смолы, чтобы обеспечить надлежащее таргетинга позже в сфокусированном ионной балке сканирующего электронного микроскопа.
Для начала используйте пипетки, чтобы капать одну каплю 20%PVP PBS на режущей коврик. Погрузите в каплю расчлененный nervus tibialis. Используйте скальпель, чтобы сократить длину в два миллиметра образца.
Используйте тонкие типсы, чтобы поместить образец в 0,2 миллиметра глубиной типа А металлический образец перевозчика. Перенесите носитель в среднюю пластину картриджа. Поместите гексадекан покрытием типа B перевозчика на верхней в качестве крышки.
Закройте сборку, опустив верхнюю половину картриджа. Закройте картридж из трех частей в погрузочной станции морозильной камеры высокого давления. Нажмите кнопку процесса и продолжайте в соответствии с инструкциями производителя по эксплуатации.
В ванне с жидким азотом поместите образцы носителей в крио-флаконы, содержащие два миллилитра замороженной 0,1%-ного таниновой кислоты и ацетона, и закройте колпачки. Поместите флаконы крио в блок замены замораживания при температуре минус 90 градусов по Цельсию. Запустите программу и держите образцы там в течение 100 часов.
В блоке замены замораживания трижды в течение 30 минут промывают образцы двумя миллилитров ацетона. Поместите 2%osmium тетроксида в 0,1%уранил ацетат в блок замораживания замены для охлаждения и добавить его в образцы в течение семи часов продолжает окрашивание при минус 90 градусов по Цельсию. Когда температура программы в блоке замены замораживания достигает минус 20 градусов по Цельсию, держите образцы там еще 16 часов.
Когда температура поднимется до 4 градусов по Цельсию, отбросьте жидкость во флаконах и заполните чистый ацетон. Удалите крио флаконы из блок замены замораживания. Обработка образцов перед замораживанием и после осмофификации имеет решающее значение, так как образец может быть серьезно поврежден.
В дымовой капот, использовать тонкие типсы, чтобы удалить металлические носители из флаконов крио и передачи образцов от носителей, чтобы подзарядить их в 150 миллиметров глубоко смотреть стеклянную тарелку заполнены ацетоном. Используйте тонкие типсы для передачи образцов в две миллилитровые реакционной трубки, наполненные ацетоном. Установите микроволновую печь на 250 Вт в течение 40 секунд и начать микроволновую печь, чтобы мыть образцы и повторить четыре раза.
Pipette один миллилитр 1%thiocarbohydrazide раствор в реакционной трубке и положить его в микроволновую печь. Включите вакуумную функцию с двумя минутами и двумя минутами, итерируя в общей сложности 14 минут и установите ее на 150 Вт. Запустите микроволновую печь.
Вымойте образец четыре раза в ацетон, как и раньше. Pipette один миллилитр 2%osmium тетроксид раствор в реакционной трубке. Поместите образец в микроволновую печь и используйте те же микроволновые настройки, что и с тиокарбогидразидом.
Вымойте образец четыре раза в ацетон, как и раньше. Пипетт один миллилитр 25%смолы в ацетоне в реакционной трубке и положить его в микроволновую печь. Включите вакуумную функцию в течение трех минут и установите ее на 250 Вт.
Запустите микроволновую печь. Используйте зубочистку, чтобы удалить нервную голени из реакционной трубки и поместить их на кусок пластиковой пленки. Поместите галогенную лампу рядом с образцами для нагрева смолы.
Используя зубочистку, аккуратно нажмите образец вокруг на пластиковой пленке, пока не будет обнаружена оставшаяся смола. Положите пластиковую пленку с образцом сверху в духовку и установите температуру на 60 градусов по Цельсию, чтобы полимеризировать образцы, по крайней мере 48 часов. Используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать полимеризованные образцы вместе с пластиковой пленкой размером, подходящим для заглушки SEM.
Используйте зубочистку, чтобы добавить проводящие смолы серебра на SEM заглушки и прикрепить разрез образцов к нему. А затем добавить смолы вокруг образцов. Положите SEM заглушки в духовку для полимеризации при температуре 60 градусов по Цельсию, по крайней мере 4 часа или на ночь.
После полимеризации, положение SEM заглушки в распылитель. Установите распылитель на 35 миллиампер и нанесите 10 нанометров толщиной золотое покрытие или пальто в течение одной минуты. После покрытия поместите заглушки SEM внутри сфокусированного ионной балки сканирующего электронного микроскопа.
В этом исследовании, расширенный протокол был выполнен для nervus tibialis мыши, а также C.elegans, чтобы проиллюстрировать оптимальное сохранение и контраст для выполнения 3D объем изображения с сфокусированным ионным лучом сканирования электронного микроскопа. Стандартные протоколы часто страдают от отсутствия контраста мембран, где, как расширенный протокол обеспечивает сильный контраст мембраны. Поперечные изображения C.elegans с улучшенным протоколом и стандартным протоколом показывают отличительную разницу.
Как и для поперечных изображений nervus tibialis, расширенный протокол помогает показать более сильный контраст мембраны по сравнению со стандартным протоколом. После постобработки данные электронного микроскопа визуализируются с помощью IMOD, программы обработки изображений и моделирования. Область синего выделений показывает сегментированные аксоны.
На красной выделенной области показаны пучки Remak. Области с желтым и оранжевым выделением показывают миелиновые оболочки. А в бирюзовом районе показаны митохондрии.
Виртуальная нарезка и трехмерная модель иллюстрируют архитектуру тонкой ткани и помогают понять ее функцию. Можно использовать и другие методы сканирования электронов, такие как серийная блок-лицевая сканирующая электронная микроскопия и томография массива. Этот протокол также может быть использован для передачи электронной микроскопии и других типов образцов, таких как образцы из центральной нервной системы.
Осмий тетроксид, тиокарбогидрозид и ацетат уранила являются токсичными химическими веществами и должны использоваться тщательно. Смола также вредна и должна использоваться с осторожностью. Личное защитное оборудование, такое как перчатки и лабораторное пальто, следует носить для полного протокола.
Обзор
В данном исследовании представлен усовершенствованный протокол подготовки образцов, сочетающий высокоpressure-замораживание и микроволновую обработку для улучшения сохранения ультраструктуры и повышения контрастности при визуализации. С использованием большеберцового нерва мыши и Caenorhabditis elegans в качестве модельных систем данный метод демонстрирует значительные преимущества по сравнению со стандартными протоколами в отношении контрастности мембран и возможностей 3D-визуализации.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Микроскопия
- Методы визуализации
- Подготовка образцов
Теоретические основы
- Сохранение ультраструктуры имеет решающее значение для эффективной визуализации.
- Стандартные протоколы часто не обеспечивают достаточного контраста для определенных типов тканей.
- Комбинирование нескольких методов может улучшить результаты визуализации.
Используемые методы
- Замораживание под высоким давлением и обработка образцов с помощью микроволнового излучения
- Большеберцовый нерв мыши и Caenorhabditis elegans
- Сканирующая электронная микроскопия с фокусированным ионным пучком (FIB-SEM)
Основные результаты
- Улучшенный протокол обеспечивает более высокую контрастность мембран по сравнению со стандартными методами.
- Изображения поперечного сечения демонстрируют отчетливые различия в визуализации структуры.
- Полученные результаты подтверждают эффективность данного протокола для детального получения 3D-изображений объема.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует, что сочетание определенных методов обработки значительно улучшает качество визуализации.
- Данный протокол применим для различных биологических образцов и может помочь в изучении архитектуры тканей.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный протокол устраняет критический пробел в ультраструктурной визуализации, когда стандартное высокодавлениевое замораживание не обеспечивает достаточного контраста для объемной визуализации с помощью FIB-SEM. За счет повышения контраста мембран путем окрашивания с использованием микроволнового излучения и минимального внедрения в смолу обеспечивается надежная 3D-реконструкция нервных тканей. Это способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков в процессах нейробиологических исследований путем предоставления прогностических высокоточных структурных данных.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы благодаря сохранению ультраструктуры и усилению мембранного контраста в нервных тканях.
- Практическая ценность: снижает неоднозначность при изучении взаимодействия с мишенями, обеспечивая четкую визуализацию архитектуры аксонов и миелина.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем с количественными ультраструктурными данными для последующего скрининга соединений.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет стабильного усиления контраста и минимального использования смол при заливке.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает моделирование патологических процессов за счет сохранения тонкой архитектуры тканей в образцах центральной нервной системы.
- Практическая ценность: обеспечивает преемственность от этапа первичных исследований до доклинической валидации посредством воспроизводимой генерации данных о 3D-объемах.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от идентификации мишени до доклинической оценки, что особенно актуально для нейробиологических программ, требующих структурной валидации.
- Биология открытий: Способствует проверке гипотез и уточнению путей за счет визуализации субклеточных структур, имеющих критическое значение для функции нейронов.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет получения воспроизводимых высококонтрастных образцов, подходящих для автоматизированных рабочих процессов FIB-SEM визуализации.
- Аналитика: Позволяет получать количественные морфометрические показатели (например, диаметр аксона, толщина миелина), которые делают возможным сравнительный анализ при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают преемственность доклинических исследований путем моделирования архитектуры тканей, имеющей отношение к механизмам развития нейропатий.
- Корпоративное повторное использование: Создает многоразовую платформу для ультраструктурной валидации в рамках нескольких программ по изучению нейронных мишеней.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в ультраструктуре нейронов.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость подготовки образцов для крупномасштабных кампаний по имиджингу.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») на основе надежных структурных биомаркеров, что снижает биологические риски на поздних стадиях программ по ЦНС.
- Влияние на портфель: Приоритизация нейрональных мишеней с учетом рисков на основе валидированных ультраструктурных фенотипов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области высокобарической заморозки, микроволновой обработки и электронной микроскопии.
- Необходим доступ к установкам для высокобарической заморозки, микроволновым процессорам, FIB-SEM и напылителям.
- Для получения воспроизводимых результатов необходима межгрупповая стандартизация между подразделениями гистологии, визуализации и анализа данных.
- Адаптация метода для различных модельных систем (например, мыши, C. elegans, тканей человека) требует оптимизации времени окрашивания и заливки.
- Практические ограничения включают работу с токсичными реагентами (тетраоксид осмия, ацетат уранила) и длительное время обработки при криозамещении и полимеризации.
