Позиционирующее устройство для размещения мышей во время интраназального siRNA Доставка в центральную нервную систему
15 августа 2019 г.
Здесь мы представляем протокол с помощью устройства позиционирования мыши, которое позволяет соответствующее размещение мышей для интраназального введения мозга таргетинга пептид-siRNA формулировки, позволяющей эффективное заглушивание гена в центральной нервной системе.
В этом протоколе подробно рассматривается использование устройства позиционирования для интраназальной доставки биомолекул к мыши ЦНС. Использование этого устройства значительно снижает управляемость мышей и время лечения, что приводит к повышению эффективности и воспроизводимости техники. Чтобы начать эту процедуру, оценить уровень анестезии мышей педаль рефлекс для того, чтобы поддерживать хирургическую плоскость.
Затем поместите устройство позиционирования на соответствующее расстояние и высоту, чтобы обеспечить удобный доступ ко всем необходимым реагентам. Затем нанесите мазь на глаза животного. Ремешок одной мыши с ремнями стула, убедившись, что конечности мыши обеспечивают естественную поддержку в то время как он находится в расслабленном положении без какого-либо дискомфорта.
Повторите процедуры для оставшихся мышей. Аккуратно поместите каждую мышь на назначенный стул, положив спину параллельно спинкам спинки стула и при 90 градусах к стулу сиденья. Пусть животное лежит естественно в голове вниз и вперед позиции без нажатия или нажатия.
После того, как все мыши привязали, немедленно начать интраназальной прививки. Для выполнения интраназальной доставки загрузите микропипюту двумя микролитровами комплексного раствора RVG9R siRNA. Держите пипетки в доминирующей руке и поддержите его с другой стороны, чтобы избежать неконтролируемых движений при введении siRNA.
Поместите около двух капель микролитров очень близко к одной ноздре, так что мышь может непосредственно вдыхать его. Если крошечная капля не легко образуется, замените наконечник пипетки на новый и повторите операцию. Аккуратно нажмите голову мыши вниз указательным пальцем в течение пяти секунд, пока она вдыхает и поддерживать положение.
Для предотвращения дренажа препарата в легкие важно, чтобы богато нажмите голову мыши вниз указательным пальцем в течение пяти секунд, пока мышь вдыхает. Запустите секундомер, чтобы часы три-четыре минуты после этого время прививки во второй нар первой мыши. Этот промежуток времени необходим для мыши, чтобы завершить вдыхание первой дозы и восстановить нормальное дыхание.
В трех-четырехминутный интервал между прививкой альтернативных нарес на первой мыши, полная интраназальная прививка одного нара в каждой из оставшихся трех мышей, размещенных на устройстве. Когда секундомер звучит, привить вторую ноздрю на первой мыши и повторить процедуру для других мышей, как указано выше. Повторите процедуру до тех пор, пока для всех четырех мышей не будут доставлены от 20 до 30 микролитров.
Это займет от 30 до 45 минут, чтобы завершить всю процедуру прививки. Верните животных обратно в назначенные клетки. Не оставляйте мышей без присмотра, пока они не пришли в достаточное сознание для поддержания стернальной лежачих.
Для оценки глушивания генов, извлечения РНК из различных областей мозга с набором очистки РНК, обратной транскрипции в cDNA с помощью комплекта синтеза cDNA, и выполнять qPCR с грунтовки пар. Большинство доставки мозга пептида RVG9R помечены Alexa Fluor 488 был впервые протестирован с помощью мыши позиционирования устройства, описанного здесь. В 48 часов после прививки, различные органы были вырезаны для измерения A488 флуоресценции.
Ни в одном из органов отрицательного контроля ничего не обнаружено. С другой стороны, сильный флуоресцентный сигнал A488 был обнаружен исключительно в мозге привитой группы RVG9R. Кроме того, положение мыши было сравнено с методом положения на спине и методом бодрствования для эффективности.
Результаты показали, что позиционирование мышей голову вниз и вперед улучшилось penetrance и осаждения RVG9R A488 по всей ткани мозга. Для дальнейшего подтверждения доставки siRNA в мозг, полное сканирование мозга было выполнено после одного интраназального введения RVG9R комплекс с Cy5 помечены siRNA. В отличие от PBS или RVM9R, комплексирование с RVG9R привело к сильному накоплению siRNA в основных областях мозга, включая обонятельную лампу, кору, гиппокамп, таламус, гипоталамус, средний мозг и мозжечок.
Устройство позиционирования может быть использовано для доставки лекарств или молекул мыши ЦНС. Приложения распространяются на тестирование терапевтических средств, а также изучение клеточных механизмов в ЦНС. Это устройство позиционирования было использовано следователями для демонстрации потенции siRNAs в лечении болезни вируса Западного Нила, а также изучение методов лечения других заболеваний ЦНС.
Обзор
В данном протоколе описывается использование устройства для позиционирования мышей при интраназальном введении препаративной формы пептид-сиРНК, нацеленной на головной мозг, что способствует эффективному сайленсингу генов в центральной нервной системе. Этот метод повышает эффективность и воспроизводимость, минимизируя необходимость в ручных манипуляциях с мышами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Генная терапия
- Биомолекулярная доставка
Обзор
- Интраназальное введение является перспективным путем доставки препаратов для терапии заболеваний ЦНС.
- Эффективные методы введения имеют решающее значение для воспроизводимости результатов.
- Положение мыши может влиять на эффективность доставки препарата.
- Сайленсинг генов с помощью siRNA является ценным инструментом в нейробиологических исследованиях.
Цель исследования
- Разработать протокол эффективного интраназального введения siRNA в ЦНС мыши.
- Оценить влияние положения тела мыши на эффективность доставки препарата.
- Продемонстрировать применимость устройства для позиционирования в задачах генной терапии.
Используемые методы
- Оценка уровня анестезии у мышей перед позиционированием.
- Использование устройства для позиционирования для фиксации мышей в расслабленном состоянии.
- Интраназальное введение раствора комплекса siRNA.
- Экстракция РНК и qPCR для оценки эффективности сайленсинга генов.
Основные результаты
- Наблюдалось значительное сайленсинг генов в областях мозга после инокуляции.
- Повышенная эффективность доставки siRNA при использовании позиционирующего устройства по сравнению с другими методами.
- В мозге обработанных мышей обнаружена сильная флуоресценция, что свидетельствует об успешной доставке.
- Позиционирование головы вниз улучшило проникающую способность и распределение формуляции siRNA.
Выводы
- Устройство для позиционирования мышей эффективно для доставки препаратов в ЦНС.
- Данный метод может быть применен в различных терапевтических и исследовательских контекстах.
- В дальнейших исследованиях можно изучить возможность его использования при лечении заболеваний ЦНС.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Эффективная интраназальная доставка терапевтических средств, направленных на ЦНС, остается критическим препятствием в доклинических нейронауках и разработке генной терапии. Данное позиционирующее устройство обеспечивает стандартизированное высокопроизводительное введение биомолекул, таких как siRNA, пептиды или наночастицы, в мозг мыши, повышая воспроизводимость и снижая вариативность в исследованиях взаимодействия с мишенью. Обеспечивая стабильное положение головы, наклоненной вниз и вперед, устройство повышает прогностическую достоверность поглощения препаратами ЦНС и снижает риски при трансляционном продвижении кандидатов в интраназальные терапевтические средства.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет точно проверять терапевтические гипотезы, обеспечивая воспроизводимую доставку активных в ЦНС соединений, таких как комплексы RVG9R-siRNA.
- Практическая ценность: снижает зависимость вариабельности дозирования от оператора, что способствует надежной оценке взаимодействия с мишенью и модуляции путей.
- Прогностическая достоверность: повышает согласованность показателей биомаркеров, таких как сайленсинг генов или нокдаун белков, в различных группах лечения.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет подготавливать стандартизированные биологические системы для последующего скрининга, обеспечивая равномерную доставку соединений в ЦНС.
- Практическая ценность: Способствует воспроизводимости анализа за счет контролируемого позиционирования животных и снижения стресса при манипуляциях.
- Повторное использование платформы: Поддерживает оценку различных модальностей, включая siRNA, наночастицы и антитела, для доставки в ЦНС.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает соответствие модели заболеванию за счет возможности стабильного введения препаратов в ключевые области мозга, задействованные в моделях нейродегенерации или вирусной инфекции.
- Операционная ценность: Позволяет проводить быстрое тестирование терапевтических кандидатов благодаря параллельной обработке до восьми мышей за одну сессию.
- Прогресс с учетом рисков: Поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), повышая достоверность данных о воздействии на ЦНС и модуляции мишеней.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Прибор интегрируется в рабочий процесс поиска лекарственных средств, начиная с ранней валидации мишени и заканчивая оптимизацией соединений-лидеров, что позволяет проводить надежную оценку доставки препаратов в ЦНС перед проведением исследований для подачи заявки на IND.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез за счет возможности стабильной доставки терапевтических siRNA или пептидов для подтверждения модуляции мишени in vivo.
- Скрининг: повышает готовность и воспроизводимость анализов за счет стандартизации положения животного при интраназальном введении соединений.
- Аналитика: позволяет проводить количественное сравнение поглощения ЦНС с помощью флуоресценции, qPCR или анализа биомаркеров в различных группах лечения.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность между этапом поиска и доклиническими исследованиями за счет повышения надежности показателей доставки в ЦНС, используемых при определении доз и изучении эффективности.
- Корпоративное повторное использование: служит многофункциональной платформой для оценки различных модальностей, направленных на ЦНС, в рамках разных проектов и терапевтических областей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов доставки в ЦНС и взаимодействия с мишенью за счет снижения процедурной вариабельности.
- Операционная ценность: увеличивает пропускную способность и стандартизацию, сокращая время непосредственной работы и зависимость от квалификации технического персонала.
- Стратегическая ценность: способствует принятию более обоснованных решений о продолжении или прекращении разработок за счет повышения качества данных и снижения количества ложноотрицательных результатов в анализах доставки в ЦНС.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию кандидатов для интраназальной терапии с учетом рисков на основе воспроизводимых данных о поглощении вещества ЦНС.
Особенности реализации
- Требуется подготовка по методам оценки анестезии и правильной фиксации животного для обеспечения комфорта и корректного позиционирования.
- Зависит от наличия оборудования для интраназального введения, такого как микропипетки и стерильные наконечники, для обеспечения стабильного формирования капель.
- Необходима стандартизация работы между исследовательскими группами для обеспечения единообразного наклона головы вперед и вниз, а также соблюдения временных интервалов между инокуляциями в каждую ноздрю.
- Метод должен быть адаптирован для различных линий или размеров мышей с помощью регулировки высоты и угла наклона кресла.
- Применимо только для процедур, требующих точного интраназального введения; не подходит для внутривенного или перорального способов введения.
