Лицевая хирургия нерва в модели крыс для изучения аксоналинизм и регенерации
5 мая 2020 г.
Этот протокол описывает воспроизводимый подход к хирургии лицевого нерва в модели крысы, включая описания различных индуцирующих моделей травмы.
Этот протокол может помочь ученым изучить результаты после травмы лицевого нерва и методы для улучшения регенерации по многим различным параметрам. Основным преимуществом этой техники является то, что анатомия крысы позволяет легко получить доступ к лицевому нерву, и его большой масштаб позволяет нам изучить все соответствующие модели травмы. Применение этого метода распространяется на реабилитацию пациентов после травмы лицевого нерва.
В качестве регенеративного потенциала крыса обеспечивает воспроизводимую и краткую экспериментальную модель. И этот метод может обеспечить понимание хирургической и медицинской терапии для лицевого нерва парез или паралич. И это переводится на другие модели головы и шеи или других периферических нервов.
Работа под микроскопом с помощью обеих рук может быть сложной задачей. Я рекомендую практиковать использование бинокулярной версии под микроскопом, прежде чем пытаться вскрытия лицевого нерва. После подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноги, нанесите мазь на глаза крысы и побрить хирургическую область.
Установить метод идентификации крыс и поместить рулон марли под шею. Дезинфицировать открытые кожи с тремя чередующихся хлоргексидина и 70% этанол скрабы и поместить крысу под стерео микроскопом. Манипулируйте ипсилатеральным ухом в передне-заднем направлении, чтобы определить естественную складывание послеоперационной кожи.
Используйте лезвие номер 15, чтобы сделать разрез длиной от двух до трех миллиметров в послеоперационной складке. Планирование и размещение разреза являются наиболее важными шагами для обеспечения надежной идентификации лицевого нерва при минимизации размера раны. Тупо вскрыть через немедленно подкожной фасции и место микро-Weitlaner ретрактор для повышения воздействия тканей.
Определите переднюю digastric мышцу по мере того как она перемещает в более низко-к-превосходном направлении к своей вставке вдоль основания черепа. Распространение мягко через мышечный живот вдоль точки вставки мышцы, чтобы выявить сухожилие передней digastric живота. Сухожилие будет отображаться как фильмивный белый процесс, исходящий из мышцы с твердой вставкой на основание черепа.
После выявления передней дигострической мышцы и сухожилия, отрегулируйте ретрактор Weitlaner для дальнейшего втягивать мышечный живот. Открытой областью является трехмерное пространство, в котором находится основной ствол лицевого нерва. Рассекаете вдоль нерва в низшем направлении distally от выхода стиломастоида foramen.
Чтобы вызвать давку травмы картины, использовать гладкой поверхности forceи ювелира твердо схватить и сжать нерв применения постоянного и воспроизводимого давления в течение 30 секунд, чтобы обеспечить соответствующую травму раздавить. Для простой трансекции, понять немедленное эпиневризии overlying нерва с тонкозубыми типсами, и использовать острые микросциссоры, чтобы чисто трансектировать нерв в нужной точке с одного разреза. Для модели разрыва нерва, используйте регулируемые calipers для того чтобы установить пожеланную длину зазора нерва нерва для того чтобы обеспечить подобные картины ушиба между животными и transect нерв как как раз продемонстрировано.
После того, как экспериментальная травма была доставлена, орошать рану стерильным солевым раствором и высушить ткань стерильной марлей. перед закрытием разреза кожи в соответствии с институциональными руководящими принципами. Здесь показана живая визуализация основного ствола лицевого нерва с травмой раздавить примерно два-три миллиметра дистал к точке ветви первого PES у взрослой трансгенной крысы Thy1-GFP.
Оценка постепенного возвращения флуоресценции в течение одной, двух, трех и четырех недель после травмы может быть использована в качестве маркера для мониторинга регенерации нервов у этих трансгенных животных. Гистоморфометрический анализ может быть использован для получения поперечных изображений маргинального мидибулярного деления, позволяющего количественно оценить аксональный диаметр, количество мусора, нервное волокно, процент нервных и плотность измерений. Важно часто корректировать размещение ретрактора по мере необходимости, чтобы убедиться, что соответствующие анатомические нервы видны при определении лицевого нерва.
После этой процедуры соответствующие нервы и мышцы могут быть собраны для иммуногистохимического анализа для оценки степени регенерации по сравнению с другими экспериментальными группами. После его развития, этот метод проложил путь для исследователей в изучении функциональных результатов после травмы лицевого нерва. В частности, как подать в действие явление синкинеза.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе подробно описан воспроизводимый подход к хирургическому вмешательству на лицевом нерве крысы, с особым вниманием к характеру повреждений и результатам регенерации. Он позволяет исследовать хирургические методы и терапевтические подходы к реабилитации при повреждении лицевого нерва.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Регенеративная медицина
- Животные модели
Теоретические основы
- Модель на крысах обеспечивает легкий доступ к лицевому нерву.
- Данная хирургическая техника позволяет оценивать повреждение нерва и методы его регенерации.
- Анатомические особенности крысы позволяют детально изучить различные варианты повреждений.
Цель исследования
- Оценка терапевтических подходов к лечению пареза или паралича лицевого нерва.
- Углубление понимания процессов регенерации после повреждений лицевого нерва.
- Разработка детальной хирургической методики, которая может быть воспроизведена в различных исследованиях.
Используемые методы
- В исследовании используется модель крысы для хирургического вмешательства на лицевом нерве.
- Основные процедуры включают раздавливание и пересечение нерва; для обеспечения воспроизводимости результатов подробно описаны конкретные этапы операции.
- Для мониторинга результатов регенерации применяются прижизненная визуализация и гистоморфометрический анализ.
- Особое внимание уделяется методическому препарированию под микроскопом, что требует соответствующего навыка и подготовки.
Основные результаты
- Успешная визуализация и манипуляция лицевым нервом позволяют оценить регенеративные процессы.
- Флуоресцентная визуализация и гистоморфометрический анализ обеспечивают количественную оценку восстановления нерва.
- Данный метод позволяет получить важные сведения о феноменах синкинезии после повреждения нерва.
Выводы
- Данное исследование устанавливает базовый протокол для анализа повреждения и регенерации лицевого нерва.
- Оно позволяет исследователям изучать функциональные результаты и терапевтические подходы в нейрореабилитации.
- Методология имеет важное значение для более широкого применения в исследованиях периферических нервов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Модель повреждения лицевого нерва у крыс представляет собой воспроизводимую платформу для оценки регенерации и ингибирования аксонов, что способствует валидации мишеней при разработке нейрорегенеративных терапевтических средств. Масштабируемость и анатомическая доступность данной модели позволяют проводить последовательную оценку характера повреждений и регенеративных ответов, облегчая доклиническую проверку безопасности и эффективности нейротрофических или антиингибиторных препаратов-кандидатов. Эта модель связывает этап фундаментальных открытий с трансляционными исследованиями, предоставляя количественные гистоморфометрические и функциональные показатели, имеющие значение для стратегий восстановления лицевого нерва у человека.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать механизмы аксонального торможения и пути регенерации после определенного раздавливания, пересечения или разрыва нерва.
- Операционная ценность: обеспечивает стабильную доставку нейроактивных реагентов или клеток для оценки взаимодействия с мишенью и модуляции сигнальных путей.
- Прогностическая ценность: гистоморфометрическая количественная оценка диаметра аксонов, плотности волокон и очистки от клеточного дебриса предоставляет объективные показатели эффективности мишени и снижения механистических рисков.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Создаются стандартизированные модели повреждений, подходящие для высоковоспроизводимого скрининга прорегенеративных соединений или ингибирующих антагонистов.
- Количественные показатели: Визуализация флуоресцентно-меченых аксонов в режиме реального времени и гистоморфометрический анализ позволяют осуществлять количественное лонгитюдное отслеживание регенерации.
- Масштабируемость: Модель на крысах позволяет проводить хирургические манипуляции на различных сегментах нервов — от внутричерепных до экстратемпоральных, что обеспечивает возможность многопараметрической оценки.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: облегчает оценку функционального восстановления и минимизации синкинезий, что соответствует клиническим конечным точкам реабилитации лицевого нерва.
- Доклиническое моделирование: позволяет оценивать манипуляции на уровне центральных структур или органов-мишеней, а также методы клеточной терапии в системе периферических нервов, релевантной конкретному заболеванию.
- Прогресс с учетом рисков: надежные показатели выживаемости и межвидовая согласованность данных обосновывают решения о целесообразности дальнейших исследований перед переходом к моделям на видах более высокого порядка.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель интегрируется в рабочие процессы поиска новых лекарственных средств, обеспечивая валидацию мишеней посредством контролируемого повреждения нерва, последующую разработку методов анализа для скрининга соединений, а также поддержку доклинической оценки регенеративной терапии с помощью показателей функциональных и структурных исходов.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез об ингибиторах и промоторах роста аксонов с помощью стандартизированных парадигм повреждения.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые модели повреждения нерва для оценки влияния соединений на кинетику и точность регенерации.
- Аналитика: гистоморфометрические и флуоресцентные показатели предоставляют количественные данные для анализа зависимости «доза-эффект» и степени взаимодействия с мишенью.
- Трансляционные исследования: связывают показатели регенерации аксонов с функциональными исходами, такими как синкинезия, что подтверждает клиническую значимость.
- Повторное использование в масштабах предприятия: создает многоразовую хирургическую платформу для итерационного тестирования различных терапевтических методов и временных точек.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в исследованиях регенерации аксонов за счет количественных и воспроизводимых показателей повреждения и восстановления.
- Операционная ценность: Стандартизированные хирургические методы и протоколы послеоперационной оценки повышают согласованность данных между различными лабораториями и их надежность.
- Стратегическая ценность: Облегчает принятие ранних решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет уточнения биологии мишени и снижения риска неудач на более поздних этапах нейрорегенеративных программ.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию нейрорегенеративных кандидатов с учетом рисков на основе валидированной модуляции мишени в клинически значимой модели периферического нерва.
Особенности реализации
- Требуются навыки микрохирургии и знание нейроанатомии грызунов при работе под стереомикроскопом.
- Необходимость в специализированных инструментах, включая микроретракторы Weitlaner, ювелирные пинцеты, микроножницы и регулируемые штангенциркули для стандартизированного нанесения повреждений.
- Необходимость использования трансгенных репортерных линий (например, Thy1-GFP) или иммуногистохимической обработки для продольного отслеживания аксонов и гистоморфометрического анализа.
- Требуются протоколы послеоперационного ухода для обеспечения выживаемости крыс и минимизации вмешивающихся факторов при оценке регенерации.
- Ограниченные возможности генетических манипуляций по сравнению с мышиными моделями могут затруднить изучение механизмов с помощью методов нокаута или гиперэкспрессии генов.
