Индукция и характеристика легочной гипертензии у мышей с использованием модели Hypoxia/SU5416
3 июня 2020 г.
Этот протокол описывает индукцию легочной гипертензии (PH) у мышей на основе воздействия гипоксии и инъекции антагониста рецепторов VEGF. У животных развивается гипертрофия PH и правого желудочка (Р.В.) через 3 недели после начала протокола. Представлена также функциональная и морфометрическая характеристика модели.
Этот протокол может быть использован для индуцирования легочной гипертензии и для выполнения функциональных измерений правого желудочка. Модель Sugen Hypoxia проста в реализации и может повторить некоторые признаки легочной гипертензии в течение двух-трех недель после индукции. Используя эту модель, мы можем определить новые пути, участвующие в развитии болезни.
Мы можем определить новые цели и проверить их терапевтический потенциал. Перед началом процедуры индукции, безопасные резервуары азота вблизи гипоксической камеры и установить кислородный контроллер в точке 10%кислорода. Затем загрузите свежеприготовленный раствор SU5416 в один миллилитровый шприц, оснащенный иглой 25 калибра, и вручную сдерживайте первое животное, которое будет введено.
Возьмитесь за кожу, чтобы сформировать палатку параллельно позвоночнику убедившись, чтобы схватить затылок плотно, чтобы избежать потенциальной травмы укуса мышью. Вставьте иглу подкожно над флангом на свободной складке кожи параллельно коже и доставить 100 микролитров содержимого шприца. Через 10 секунд свями иглу и верните животное в клетку.
Когда все животные были введены, поместите мышей в проветриваемой гипоксии камеры. Для воздействия гипоксии, подтвердите, что камеры оснащены датчиком кислорода для измерения уровня кислорода и открыть камеры не более 20 минут каждые три дня для очистки и добавления пищи и воды. Осматривайте животных ежедневно на наличие признаков стресса и повторяйте инъекцию SU5416 еженедельно в течение трех недель подряд.
Перед началом процедуры измерения давления подготовьтесь к разъему трубки Y и используйте ручной режим для проверки функции вентилятора. Установите вовратное давление до менее чем одного сантиметра воды, чтобы избежать баротравмы и установите частоту дыхания до 110 вдохов в минуту. Вырезать 20 калибровочный внутрисосудистый катетер, чтобы создать эндотрахеаную трубку и включить блок контроля громкости давления.
Инициировать программное обеспечение для сбора данных и поместить катетер громкости давления в 15 миллилитровую центрифугу трубки PBS в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Затем откалибровать катетер в соответствии с протоколом производителя. Поместите мышь на грелку и поместите ректальный зонд для мониторинга температуры тела.
Далее, подтвердить отсутствие ответа на боль в крайнем случае в анестезированной мыши и брить шею и грудь областях. Защитите конечности мыши хирургической лентой и сделайте один сантиметровый разрез в медиальной коже шейки матки. Использование хлопка наконечником аппликатора, прямо отделить околоушных и подукрепленных слюнных желез подвергать мышцы, лежащие в основе трахеи.
Тщательно сократить мышцы, чтобы полностью разоблачить трахею и использовать ножницы, чтобы сделать небольшой разрез между трахеей хрящей. Вставьте подготовленную эндотрахеаную трубку и удалите металлический направляющий выступ внутрисосудистого катетера. Затем подключите катетер к аппарату искусственной вентиляции легких и проинтуйте положение трахеальной трубки, вручную надув легкие.
Закрети положение лентой. Для измерения давления правого желудочка, сделать один сантиметр кожи разрез над процессом xiphoid и верхней части живота и, начиная с средней линии дистальной к xiphoid и тщательно движущихся боковой с обеих сторон, отделить кожу над грудью и брюшной стенки. Открывая брюшную полость, тщательно перережьте диафрагму, заботясь о том, чтобы не повредить бьющееся сердце или легкие.
И использовать хлопок наконечником аппликатора, чтобы аккуратно удалить перикард. Принесите катетер давления рядом с мышью и используйте хлопок наконечником аппликатор оснащен иглой, чтобы сделать ножевое ранение в нетипичной дистальной части правого желудочка. Тщательно замените иглу катетером давления, вставив катетер давления параллельно направлению правого желудочка кончиком, обращенный к легочной артерии.
Следите за отслеживанием волны давления, чтобы обеспечить правильное позиционирование катетера. Как только сигнал давления стабилизируется, приохтять дыхание и получить по крайней мере три измерения. Когда все измерения были записаны, осторожно вернуть катетер в PBS заполненные центрифуги трубки в водяной бане.
Здесь показаны кривые репрезентативного давления и количественный анализ давления правого желудочка в конце периода наблюдения. Гистологический анализ реконструированных легочных артерий после гипоксии плюс лечение SU5416 показывает увеличение толщины медиальной стенки по сравнению с нормоксическими животными. Окрашивание агглютинина пшеницы для оценки гипертрофии кардиомиоцитов указывает на то, что гипоксия плюс воздействие SU5416 приводит к заметному увеличению размера кардиомиоцитов и гипертрофии правого желудочка.
Кроме того, морфометрическая оценка гипертрофии правого желудочка путем измерения индекса Фултона подтверждает увеличение гипертрофии правого желудочка у гипоксических животных. Выполнение функциональных измерений важно, чтобы избежать кровотечения, потому что это может негативно повлиять на результаты исследования. Этот протокол также может быть использован для индуцирования легочной гипертензии у крыс только с небольшими изменениями.
Примечательно, что только одной инъекции Сугена у крыс достаточно, чтобы вызвать легочную гипертензию.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот протокол описывает индуцирование легочной гипертензии (ЛГ) у мышей путем воздействия гипоксии и инъекции антагонистов рецепторов VEGF. Модель позволяет провести функциональную и морфометрическу характеристику ЛГ и гипертрофии правого желудочка в течение трех недель.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Кардиоваскулярная биология
- Патофизиолоия
Предпосылки
- Легочная гипертензия является серьезным состоянием, затрагивающим сердечно-сосудистую систему.
- Понимание механизмов, лежащих в основе ЛГ, может привести к новым терапевтическим мишеням.
- Модель гипоксии Sugen является широко используемым методом для изучения ЛГ у мышей.
- Антагонисты рецепторов VEGF играют роль в развитии ЛГ.
Цель исследования
- Индуцировать легочную гипертензию в контролируемой модели мышей.
- Провести функциональные измерения правого желудочка.
- Идентифицировать новые пути и терапевтические мишени для ЛГ.
Используемые методы
- Индуцирование гипоксии путем снижения уровня кислорода до 10%.
- Инъекция SU5416 для блокировки рецепторов VEGF.
- Мониторинг функции и морфологии правого желудочка.
- Характеристика модели в течение трехнедельного периода.
Основные результаты
- Развитие легочной гипертензии и гипертрофии правого желудочка.
- Функциональные измерения указывают на значительные изменения в работе правого желудочка.
- Морфологические изменения, согласующиеся с легочной гипертензией, наблюдаются.
- Идентификация потенциальных новых терапевтических мишеней для лечения.
Выводы
- Модель гипоксии Sugen эффективно имитирует легочную гипертензию.
- Эта модель может быть использована для изучения новых путей, участвующих в развитии ЛГ.
- Будущие исследования могут использовать эту модель для терапевтического тестирования.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
The hypoxia/SU5416 mouse model provides a rapid, cost-effective system for interrogating vascular remodeling and right ventricular dysfunction in pulmonary hypertension, enabling early-stage target validation and mechanistic de-risking. Its compatibility with wild-type and genetically modified mice supports pathway interrogation and therapeutic hypothesis testing within a three-week timeframe. This model bridges discovery biology and preclinical evaluation by delivering quantifiable hemodynamic and histological readouts that inform portfolio triage and risk-adjusted decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of VEGF signaling pathways and identification of novel therapeutic targets involved in pulmonary vascular remodeling.
- Operational Value: Supports rapid phenotypic screening of genetic or pharmacological interventions using standardized induction and measurement procedures.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by modeling key histopathological hallmarks of human Group 1 pulmonary hypertension, including medial wall thickening and right ventricular hypertrophy.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable outputs such as right ventricular pressure via catheterization and Fulton index for hypertrophy assessment.
- Operational Value: Delivers reproducible, low-variance measurements when combined with standardized hypoxia exposure and weekly SU5416 dosing.
- Scalability: Enables platform reuse across wild-type and knockout models without requiring surgical expertise, supporting high-throughput target validation campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system that mimics human pulmonary hypertension pathophysiology, allowing evaluation of target engagement and pathway modulation.
- Operational Value: Supports prevention and therapy studies through reversible phenotype upon normoxia return, enabling washout and rechallenge designs.
- Translational Continuity: Connects early discovery to preclinical validation by delivering functional (RV pressure) and structural (vascular remodeling, cardiomyocyte hypertrophy) endpoints aligned with clinical biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target identification, assay validation, and mechanistic de-risking before lead optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of VEGF-dependent and independent pathways in pulmonary hypertension through inducible, reversible vascular injury.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized induction (10% oxygen, weekly SU5416) and quantifiable outputs (RV pressure, Fulton index, histological thickening).
- Analytics: Provides functional hemodynamics and morphometric readouts that allow cross-group comparison and effect size estimation for target prioritization.
- Translational Research: Offers mechanistic insight into right ventricular adaptation and pulmonary artery remodeling, supporting biomarker-aligned go/no-go decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable phenotypic platform for iterative testing of targets across multiple chemogenetic or pharmacological modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by modeling human-relevant vascular and cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized hypoxia control, injection schedule, and pressure/volume catheterization techniques.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by enabling early de-risking of targets based on functional and structural disease modification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by delivering multiparametric data (pressure, hypertrophy, fibrosis) for objective target ranking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hypoxic chamber management, SU5416 handling, and right ventricular catheterization techniques.
- Dependent on precise oxygen control (10%) and access to nitrogen tanks for chamber maintenance.
- Necessitates standardized animal handling and weekly dosing to ensure model consistency across cohorts.
- Limited to mild-to-moderate phenotype severity, which may restrict modeling of advanced disease stages.
- Reversibility upon normoxia return requires careful experimental design for chronic therapy studies.
