Анализ митохондриальной дыхательной цепи комплексов в культивируемых клеток человека, используя синий родной электрофореза геля полиакриламида и Immunoblotting

Синий родной полиакриламинид гель электрофорез позволяет анализ в такт комплексов митохондриальной окислительной фосфорилирующей системы. Это удобная и недорогая техника, которая может быть использована для наложения сборки целых комплексов митохондриальной окислительной фосфорилирующей системы. Чтобы подготовить митохондриальные лисаты, сначала используйте ледяной раствор PBS, чтобы аккуратно вымыть клетки один раз.

Очистить клетки и гранулировать их при четырех градусах по Цельсию при 800 Г в течение 10 минут. Затем дважды промыть клеточные гранулы с помощью ледяного PBS и центрифуги при четырех градусах Цельсия при 800 G в течение 10 минут. Затем добавьте 200 микролитров ингибитора протеазы 100x до 20 миллилитров PBS.

Повторное приостановление клеток в смеси ингибитора ПБС протеазы до конечной концентрации белка в пять миллиграммов на миллилитр. Для подготовки 3,3 миллимолярный дигитонин в PBS с ингибитором протеазы, растворить четыре миллиграмма дигонина в одном миллилитре PBS при 100 градусах по Цельсию, пока не будет видно осадков. Немедленно охладите лед и добавьте 10 микролитров ингибитора протеазы 100x к одному миллилитру раствора дигонина.

Затем добавьте смесь ингибитора дигонина протеазы к клеткам при конечной концентрации 1,65 миллимолара. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение пяти минут. Затем добавьте в клетки смесь ингибитора ПБС протеазы до конечного объема в 1,5 миллилитров.

Центрифуга при четырех градусах Цельсия при 10 000 Г в течение 10 минут. Удалите супернатант и повторно приостанавливайте митохондриальные гранулы в митохондриальном буфере. Приготовьте один миллилитр свежего 10%loreal, установленного в растворе ингибитора PBS.

Добавьте 10%loreal mountased к митохондриям при конечной концентрации 1%Incubate на льду, по крайней мере 15 минут. Центрифуга при четырех градусах Цельсия при 20 000 Г в течение 20 минут. Соберите супернатант в новую трубку и добавьте буфер образца.

Чтобы подготовить градиентный гель для синей родной страницы, сначала поместите градиент производителя на пластину перемешивания и соедините его с гибкой трубой к перистальтическому насосу. Прикрепите набор настоя иглой к трубе. Поместите магнитный мешалку в проксимальную камеру градиентного производителя и промыть трубку дистиллированной водой с максимальной скоростью насоса в течение 10 минут.

Далее, опорожните трубки и градиент производителя. Используйте пипетки, чтобы удалить остатки дистиллированной воды в канале между камерами градиента производителя. Закройте канал и трубы с клапаном.

Соберите две стеклянные пластины в держатель и поместите его на стенде. Используя отверстие на дне держателя геля, поместите иглу, соединенную с трубами между стеклянными пластинами. Чтобы сделать гель 8,3 на 7,3 сантиметра, сначала приготовьте 6%и 15%gel растворы и держите их на льду.

Смешайте их осторожно, чтобы избежать пузырьков воздуха. Затем загрузите проксимальный конец градиентного гель-миксера трубной камерой с 2,6 миллилитров 6%геля и дистальным концом с 2,1 миллилитров 15%геля. Затем включите магнитный мешалка и откройте трубы и канал между камерами градиентного производителя.

Немедленно включите перистальтический насос до пяти миллилитров в минуту. Заполните стеклянные пластины и удалить иглу, когда нет геля в трубе. Аккуратно наложить гель с дистиллированной водой и держать гель при комнатной температуре, по крайней мере один час.

Вымойте трубки немедленно, заполнив градиентные камеры дистиллированной водой и используя перистальтический насос на максимальной скорости. Добавьте шесть миллилитров дистиллированной воды в три миллилитров буфера 3x геля, чтобы сделать 1x гель буфера. С помощью фильтровальной бумаги аккуратно удалите дистиллированную воду с поверхности геля.

Вымойте поверхность геля с 1x гель буфера, и осторожно удалить буфер с фильтровальной бумагой. Подготовь 4%укладки геля в соответствии с рукописью. Смешайте осторожно, чтобы избежать пузырьков воздуха.

Затем поместите гребень между стеклянными пластинами и залить укладки гель под гребень. Погрузите гребень полностью. Пусть укладка гель полимеризации, по крайней мере 30 минут.

Затем снимите гребень и используйте пипетку для мытья колодцев с 1x гель буфера. Для выполнения синего родного гель электрофорез, во-первых, добавить синий буфер катода на кассету геля. Используйте пипетку для мытья и заполнения колодцев синим катодным буфером.

Затем загрузите в скважины от 5 до 30 микрограммов образцов белка. Аккуратно заполните гель кассету доверху с синим катодным буфером, а бак с анодным буфером. Во-первых, запустить гель при постоянном напряжении 40 вольт в течение 15 минут.

Затем увеличьте напряжение до 80 вольт. Вы запустите гель, пока краситель не достигнет 2/3 длины геля. Замените синий катодный буфер катодным буфером и продолжайте электрофорез до тех пор, пока передняя краска не сбежать от геля.

Извлеките стеклянные пластины и перенесите белки на мембрану PVDF полусухой блоттингом. Используйте постоянное напряжение 25 вольт и ток ограничен одним ампером в течение 30 минут. Сборка респираторных цепных комплексов в клетках нейробластомы человека была ингибирована при лечении хлорамфениколом по сравнению с контрольными клетками без лечения.

В отличие от этого, комплексы, кодируемые ядерными генами, были дорегулируемы. Деградация окислительных фосфорилирующих комплексов наблюдалась на нескольких циклах замораживания-оттепели. Качество геля может повлиять на обнаружение окислительных фосфорилирующих комплексов.

Кроме того, зачистка мембраны снизила соотношение сигнала к шуму. При выполнении процедуры важно помнить о проведении простого препарата и гель-электрофореза в холодных условиях для сохранения в тактных комплексов OXPHOS. После синей родной страницы, второе измерение SDS страница может быть применена для изучения белковых поду единиц дыхательных цепных комплексов.

Голубая родная страница позволяет исследователям изучать сборку комплексов и даже суперкомплексов окислительной фосфорилирующей системы.