Продольная интравитальная визуализация поведения опухолевых клеток головного мозга в ответ на инвазивную хирургическую биопсию

Здесь мы описываем метод для высокой разрешения замедленной многофотононной визуализации опухолевых клеток мозга до и после инвазивного хирургического вмешательства (например, биопсии) в рамках одного и того же живого животного. Этот метод позволяет изучать влияние этих инвазивных хирургических процедур на мигрирующие, инвазивные и пролиферативное поведение опухолевых клеток на одном клеточном уровне.

Этот протокол позволяет пользователю изучить влияние инвазивных хирургических процедур, используемых в клинике, на поведение опухолевых клеток, таких как миграция, вторжение и распространение. Этот метод однозначно позволяет визуализировать ту же опухоль до и после инвазивной процедуры, обеспечивая понимание, которое может быть упущено в не продольном подходе. Подтвердив отсутствие реакции на щепотку носа в анестезированной взрослой мыши, смонтировать мышь на стереотаксической раме и закрепнуть голову зажимом для носа и двумя ушными прутьями.

Используйте лампу для обогрева, чтобы сохранить температуру тела, и нанесите мазь на глаза животного. Используя острые ножницы, побрить мех на черепе от глаз до основания черепа, и использовать 70% этанола для стерилизации открытой кожи. Вырезать кожу в круговой манере, и использовать ватный тампон, чтобы соскребать подвергаются periosteum.

Лечить хирургической области с каплей 1%lidocaine, и 1:100, 000 концентрации эпинефрина в течение пяти минут, прежде чем удалить избыток раствора с ватным тампоном. Используйте цианоакрилат клей придерживаться края кожи к черепу, и место стереотаксической рамы под стерео микроскопом вскрытия с 4x увеличение. Затем тщательно просверлите поверхностный диаметр в пять миллиметров, круговую канавку над правой теменной костью.

И нанесите каплю буфера коры на паз. Используйте тонкие типсы, чтобы поднять костной лоскут, чтобы визуализировать поверхность мозга, и использовать изогнутые, конические, очень тонкие точки типсов, чтобы удалить dura mater. Если кровотечение происходит, используйте абсорбируемую желатиновую губку для достижения гемостаз.

Для инъекций опухолевых клеток загрузите около трех микролитров клеток в пятикалиберный газо-жесткий шприц, оснащенный иглой в стиле тока. Зафиксните иглу на стереотаксисной руке манипулятора и удалите буфер коры из открытой ткани. Поместите кончик шприца в середину краниотомии и вставьте иглу на глубине 0,5 миллиметра от поверхности черепа.

Затем добавьте каплю буфера коры головного мозга в краниотомию и используйте инжектор микрохирурга для доставки клеток со скоростью от 250 до 400 нанолитров в минуту. Чтобы подготовить окно черепной визуализации, замените буфер коры с каплей силиконового масла на место краниотомии, чтобы избежать пузырьков воздуха под окном. Печать подвергаются мозга с шестимиллиметровой крышкой, и применять цианоакрилат клей между крышкой и черепа.

Затем используйте тонкий пинцет, чтобы мягко прижимать крышку к черепу. На соответствующей экспериментальной точке времени поместите мышь лицом вверх в коробку для визуализации и установите 25-х водную цель на самое низкое z-положение. Добавьте большую каплю воды к цели, и перенесите коробку изображений в 37 градусов по Цельсию темную климатическую камеру микроскопа.

Принесите цель к черепной визуализации окна крышки до тех пор, пока капля воды касается крышки. И используя режим эпифлуоресценции, наблюдать опухоль через окуляр, чтобы привести клетки в фокусе. Настройте лазер на правильную длину волны и выберите режим в реальном времени.

Выбрав несколько позиций, представляющих интерес для визуализации, заведи их координаты в программном обеспечении. Определите z-стек для каждой позиции, чтобы получить максимальный объем опухолевых клеток без ущерба для разрешения опухолевых клеток, с размером шага между изображениями, установленных до трех микрометров. Затем приобретайте изображения объема опухоли в разных положениях каждые 20 минут в течение двух часов, добавляя воду к цели перед каждым приобретением изображения.

После получения последнего изображения перенесите мышь на грелку с мониторингом до полного восстановления. На следующий день после первого сеанса визуализации закрепите анестезированной мыши в стереотаксисной раме, как это было продемонстрировано, и используйте пропитанный ацетоном ватный тампон, чтобы протереть края крышки до тех пор, пока клей не размягчится. Сдвиньте 25 калибровочных игл под крышкой и используйте тонкие точечные типсы, чтобы поднять ее, и увлажнить краниотомию свежим буфером коры.

Проколоть опухоль на глубину до одного миллиметра с помощью 25-го калибра иглы, остановив кровотечение стерильной желатиновой губкой, и запечатать поверхность мозга свежим силиконовым маслом. Затем приклейте новую шестимиллиметровую крышку над раной. Для анализа изображений откройте файл замедленного действия LIF в программе микроскопа и выберите вкладку Process, Process Tools и Merge.

Выберите первое изображение последовательности времени и нажмите первым. Выберите второе изображение последовательности времени и нажмите второй. В измерениях слияния выберите t для времени, затем нажмите кнопку применить.

Будет создан новый файл с двумя точками времени. После отслеживания каждой серии промежуток времени в течение трех последовательных z-стеков отдельно перетащите папку, содержащую изображения замедленного действия, в ImageJ. Выберите вкладку Плагины, Отслеживание, и MtrackJ.

Чтобы отслеживать каждую ячейку, выберите Добавить и нажмите на каждую ячейку в каждой точке времени. Затем нажмите меру, и сохранить файл, чтобы извлечь меру треков. Миграция отдельных опухолевых клеток может быть определена путем отслеживания пути миграции с течением времени в различных плоскостях xy z-stack и построена в процентах от мигрирующих клеток до и после биопсии.

Скорость распространения опухолевых клеток может быть количественно на основе H2B-тегами Dendra2 конденсата на митоз и построен в процентах от деления клеток до и после биопсии. Сравнение распределения скорости миграции до и после биопсии в той же опухоли, показывает, что количество мигрирующих клеток увеличивается после вмешательства, с сопутствующим уменьшением числа медленных и нетигративных клеток. В среднем на опухоль, 1,75-кратное увеличение доли мигрирующих клеток наблюдается, когда биопсия, как травма выполняется, по сравнению с контролем, небиопсии мышей.

Хотя процент мигрирующих опухолевых клеток в конечном итоге уменьшается как у контрольных, так и у биопсии мышей, биопсии мышей по-прежнему обладают более высокой миграционной способностью, чем контрольных мышей в целом. Пролиферативное поведение опухолевых клеток также демонстрирует 1,52-кратное увеличение числа митотических событий при биопсии с течением времени, по сравнению с небиопсийных контрольных мышей. Следует отметить, что после замены черепно-мозговой визуализации без биопсии не наблюдается индукции миграции опухолевых клеток или пролиферации, что свидетельствует о том, что повышение пролиферации опухолевых клеток и миграционных показателей конкретно вызвано биопсио-подобной травмой.

Важно работать с высокой точностью и хирургическим мастерством во время черепной визуализации, имплантации и замены шагов. Может потребоваться обширная практика.