Колориметрического анализа щелочной фосфатазы деятельность S. aureus биопленки
12 апреля 2019 г.
В этой рукописи мы создали метод высокую пропускную способность для количественного определения активности щелочной фосфатазы в S. aureus биопленки культуры от 96-луночных культуры ткани пластины
Этот протокол представил простой и надежный метод измерения алкализованной активности фосфатазы в биопленоченой культуре S.aureus. Это поможет нам понять функцию ALP в формировании биопленки. Основным преимуществом этой техники является высокая пропускная способность.
Это очень чувствительный и простой в работе. Демонстрацией процедуры будет Кевин Даниковски, бывший студент колледжа Харпер. Для приготовления TSB добавьте в дистиллированную воду поджелудочной железы кейсин, папаический дайджест соевого шрота, хлорида натрия, декстрозы и фосфата дипотазия.
Обложка колбу с алюминиевой фольгой и положить его в автоклав для стерилизации перед использованием. Чтобы подготовить TSA, добавьте агар в TSB и положите его в автоклав для стерилизации. Затем дайте ему остыть до комнатной температуры.
Затем вылейте его в чашку Петри в соотношении 20 миллилитров на тарелку. Чтобы подготовить биопленку культуры среды, добавить глюкозы в autoclaved TSB для достижения концентрации 10 граммов на литр. Используя комплект вакуумной фильтрации, фильтруйте раствор фильтром размером с 0,2 микрометра.
Чтобы привить, используйте стерилизованную петлю прививки, чтобы выбрать одну индивидуальную колонию золотистого стафилококка из чашки Петри и поместить его в культурную трубку, наполненную 10 миллилитров TSB. Положите трубку в инкубатор, чтобы расти на ночь при 37 градусах по Цельсию. С помощью микропипетта нарисуйте 100 микролитров ночной культуры и перенесите его в культурную трубку, наполненную 10 миллилитров TSB с глюкозой для разбавления соотношения объема 1:100.
Vortex осторожно смешивать для последовательной концентрации. Используйте микропипюту для передачи 200 микролитров разбавленной культуры в общей сложности 18 скважин из одной пластины 96 скважин. Инкубировать пластину 96 хорошо при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов для формирования биопленки.
Для лучшего формирования биопленки S.aureus, лучше выбрать плоский или круглый нижний 96 хорошо пластины. После этого слегка наклоните пластину, чтобы декантанта стремлением от края каждой хорошо. Вымойте каждый хорошо с 1X PBS.
Положите пластину в центрифугу, чтобы вращаться в течение пяти минут при 8000 оборотов в минуту и декантировать супернатант стремлением. Добавьте 75 микролитров буферного субстрата ALP, состоящего из коммерчески доступных PNPP к каждой колодец и используйте таймер для записи каждой точки времени в тройном. После каждой точки инкубации добавьте 75 микролитров пяти гидроксида молярного натрия в каждую из трех скважин, чтобы остановить реакцию.
Центрифуга пластины в течение пяти минут при 800 оборотов в минуту. Используйте пипетку для передачи 100 микролитров супернатанта в новую пластину 96 хорошо для калорийного измерения. Используйте 96 хорошо пластины читателя для измерения абсорбтности каждой хорошо на 405 нанометров.
Используйте 30-минутные точечные скважины для управления фоновым шумом. Повторите весь эксперимент в трех пластинах 96 хорошо. Этот протокол разрабатывает быстрый и надежный анализ для измерения активности ALP в биопленке S.aureus, которая не требует белковой изоляции.
Репрезентативный результат активности ALP показывает повышенную тенденцию на срок до 75 минут. Через 75 минут никакого увеличения активности ALP не наблюдалось. Очень важно создать хорошую культуру биопленки, и это может занять довольно много испытаний, чтобы освоить.
Вы можете подтвердить образование биопленки, выполняя кристально фиолетовый анализ, как сообщалось ранее нами и другими, или вы можете предварительно лечить пластину с человеческой плазмы для облегчения формирования биопленки. После его разработки, вы можете экран потенциальных ингибиторов ALP, которые могут помешать формированию биопленки. Результат даст важную информацию для управления биопленкой в медицинской сфере.
Пять гидроксида натрия моляра могут быть опасны в случае контакта. Обязательно носите средства индивидуальной защиты при обращении.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен высокопроизводительный метод количественного определения активности щелочной фосфатазы в культурах биопленок S. aureus с использованием 96-луночного планшета для культивирования тканей. Метод разработан с целью обеспечения высокой чувствительности и простоты выполнения, что способствует исследованию роли щелочной фосфатазы в процессе формирования биопленок.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Исследование биопленок
- Энзимология
Теоретические основы
- Щелочная фосфатаза (ALP) представляет собой фермент, участвующий в различных биологических процессах.
- Понимание роли ALP в формировании биопленок имеет решающее значение для микробиологических исследований.
- Методы высокопроизводительного анализа необходимы для эффективного сбора данных в исследованиях.
- Биопленки — это сложные сообщества микроорганизмов, которые могут оказывать влияние на здоровье человека и промышленность.
Цель исследования
- Разработать надежный метод измерения активности ALP в биопленках.
- Углубить понимание функции ALP в процессе формирования биопленок.
- Предоставить протокол, который исследователи могут легко внедрить в свою практику.
Используемые методы
- Приготовление TSB с использованием панкреатического гидролизата казеина, папаинового гидролизата соевой муки, хлорида натрия, декстрозы и гидрофосфата калия.
- Использование 96-луночного планшета для культивирования тканей для высокопроизводительного анализа.
- Измерение активности щелочной фосфатазы в культурах биопленки S. aureus.
- Демонстрация процедуры Кевином Даниковски, бывшим студентом колледжа Харпер.
Основные результаты
- Данный метод позволяет успешно количественно определить активность ALP в культурах биопленок.
- Высокая чувствительность методики обеспечивает точность измерений.
- Протокол прост в исполнении и может быть легко внедрен в различных лабораториях.
- Результаты, полученные в ходе данного исследования, могут быть использованы в будущих работах по изучению биопленок.
Выводы
- Установленный метод эффективен для изучения ALP в биопленках.
- Данное исследование способствует пониманию динамики биопленок.
- В будущих исследованиях данный протокол может быть использован для изучения других аспектов биологии биопленок.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет проводить быстрый высокопроизводительный количественный анализ активности щелочной фосфатазы в биопленках S. aureus без выделения белка, что способствует валидации мишеней на ранних этапах поиска противомикробных средств. Обеспечивая чувствительный и воспроизводимый показатель внеклеточной ферментативной активности, этот метод облегчает механическое снижение рисков при проверке терапевтических гипотез, связанных с биопленками. Совместимость анализа с форматом 96-луночных планшетов позволяет легко интегрировать его в каскады скрининга для идентификации ведущих соединений и повышения точности прогнозов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтическую гипотезу о том, что щелочная фосфатаза способствует формированию и персистенции биопленок.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишени путем количественного измерения активности фермента в интактных системах биопленок.
- Прогностическая ценность: Помогает в приоритизации портфеля препаратов, связывая модуляцию ALP с фенотипами ингибирования биопленок.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка стандартизированного высокопроизводительного формата для оценки влияния соединений на внеклеточные ферментативные маркеры.
- Количественный результат: Получение данных о поглощении на длине волны 405 nm, что позволяет проводить анализ зависимости «доза-эффект» и подтверждение попаданий.
- Масштабируемость: Использование 96-луночного планшета для обеспечения скрининга библиотек ингибиторов со средней пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболевания: Связывает активность ALP с биопленкой S. aureus, которая является ключевым фактором вирулентности при хронических инфекциях и инфекциях, связанных с установкой медицинских устройств.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает считывание данных с привязкой к биомаркеру, что служит связующим звеном между этапом поиска и доклиническими испытаниями эффективности.
- Решения с учетом рисков: Позволяет определить критерии принятия решения «продолжать/прекратить» (go/no-go) на основе взаимодействия с мишенью и фенотипического воздействия в моделях биопленок.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный анализ вписывается в континуум ранних этапов поиска, позволяя проводить валидацию мишени для последующей идентификации ведущих соединений и доклинической оценки стратегий борьбы с биопленками.
- Поисковая биология: Поддерживает проверку гипотез путем измерения активности ALP как функционального показателя метаболизма биопленки.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные данные, подходящие для скрининга библиотек соединений в микротитрационных планшетах.
- Аналитика: Предоставляет кинетические и конечные измерения, позволяющие провести статистическое сравнение условий с воздействием препарата и контрольных условий.
- Трансляционные исследования: Соответствует задачам по разработке биомаркеров, связывая ферментативную активность с формированием биопленки и потенциальным терапевтическим вмешательством.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для изучения внеклеточных ферментов в микробных биопленках в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогноза при валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности в отношении роли ALP в биопленке.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию, чувствительность и воспроизводимость благодаря простому колориметрическому анализу.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя проводить быстрый скрининг модуляторов ALP с четкими фенотипическими связями с биопленкой.
- Влияние на портфель: поддерживает принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков, связывая модуляцию мишени с антибиопленочной эффективностью.
Особенности реализации
- Требуются базовые знания в области микробиологии для стерильного культивирования биопленок и работы с S. aureus.
- Необходим доступ к планшетному ридеру для 96-луночных планшетов, способному измерять абсорбцию при 405 nm.
- Требуется стандартизация условий формирования биопленок в лунках и планшетах для обеспечения достоверности сравнений.
- При расширении метода на другие виды бактерий или внеклеточные маркеры потребуется оптимизация условий.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость контроля фоновой абсорбции и обеспечения надлежащего гашения реакции с помощью NaOH.
