Рассечение дрозофилы куколки сетчатки для иммуногистохимии, Западный анализ и РНК изоляции

Этот протокол имеет важное значение, потому что это эффективный метод для изоляции drosophila кукольной ткани глаза для нескольких приложений вниз по течению. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет быстро вскрыть большое количество куколоченных глаз, не повреждая ткани. Рассечение сетчатки щенка Drosophila будет сложной задачей для новичков.

Практика техники является лучшим способом улучшить скорость вскрытия и качество результатов. После размещения drosophila куколки на черный рассечение блюдо, заложить свежий кусок двусторонний ленты на рассечение блюдо, вдали от куколки, и использовать пару типсов, чтобы тщательно поместить куколки спинной стороны вверх на ленту. Поместите блюдо под стерео микроскопом, и использовать типсы, чтобы удалить оперкулу каждого куколки.

Используйте ножницы микроперепись, чтобы нарезать каждый корпус куколки, что позволяет ему быть хлопнул открытым, чтобы выявить голову, грудную клетку, и передний сегмент брюшной полости, и обеспечить края куколки случае двусторонняя лента. Пирс живот каждой куколки с острыми типсами, и удалить куколку из его куколки случае. Поместите куколку на блюдо для вскрытия, вдали от ленты, и накройте куколку 400 микролитров ледяной PBS.

Используйте типсы, чтобы схватить каждого из них за живот, и использовать ножницы микродиссекции, чтобы сделать один чистый поперечный разрез через грудную клетку, разрезая куколки пополам. Используя две пары тонких типсов, схватьте разрезанные края каждого эпителия грудной клетки и постепенно рвите грудную клетку и капсулу головы, обнажая глазно-мозговой комплекс и окружающие жировые ткани. Затем, не хватая ткани, используйте типсы, чтобы направлять каждый полупрозрачный, небелый, гантели формы глазного мозга комплекса, вдали от остатков головной капсулы.

После вскрытия от шести до 10 куколок, вырезать кончик микропипета с чистым лезвием бритвы диаметром около одного миллиметра, и смазать кончик смесью PBS и жира. Используйте смазаны пипетки наконечник для передачи глаз мозга комплексов в один колодец из девяти хорошо стеклянное блюдо, содержащее 400 микролитров PBS на льду, а затем передать ткани в 20 микролитров PBS в по крайней мере 250 микролитров фиксации для 35-минутной инкубации на льду. В конце фиксации используйте тот же наконечник пипетки для переноса ткани в третью колодец, содержащий 400 микролитров свежего PBS в течение пяти-десяти минут на льду.

Чтобы блокировать любые неспецифические антитела связывания, передать глаз мозга комплексов в 400 микролитров PBS плюс Triton X для 10-60-минутной инкубации на льду. В конце инкубации, aliquot 10 микролитров первичного раствора антитела в необходимое количество скважин 72-хорошо микроуэлл пластины, и использовать P10 воздуха смещения микропипетта с модифицированным 0,5-миллиметровый кончик смазывается PBS плюс Triton X для передачи не более пяти глазно-мозговых комплексов и не более трех микролитров PBS в каждой скважине антитела решения. После ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию, мыть образцы два раза в 400 микролитров PBS плюс Triton X в одном хорошо из девяти хорошо стеклянное блюдо в течение пяти до 10 минут за стирку.

После третьей стирки перенесите ткань в 100 микролитров соответствующего вторичного антитела раствора в течение двух часов при комнатной температуре, защищенной от света, после чего тремя пяти-10-минутными мойки в 400 микролитров PBS плюс Triton X и одна стирка в PBS. Затем эквивалентно использовать образцы в 200 микролитров монтажной среды в течение одного-двух часов. В конце инкубации перенесите образцы на слайд микроскопа и используйте прочную вольфрамовую иглу, чтобы прикрепить глазно-мозговой комплекс к слайду под вскрытый микроскоп.

Затем используйте тонкую вольфрамовую иглу, чтобы нарезать каждый глаз от связанной с ним оптической доли и маневрировать каждый глаз на поверхность слайда микроскопа так, что базальная поверхность глаза примыкает к слайду. Затем нанесите чистую крышку на образцы и запечатав крышку лаком для ногтей. Чтобы подготовить ткани куколки глаз для западного анализа помарки, сначала вскрыть от 10 до 16 куколок, как это было ранее продемонстрировано в двух партиях, от 10 до 15 минут друг от друга в PBS дополнены ингибиторами протеазы и фосфатазы.

После краткого полоскания изолированных глаз мозга комплексов два раза в отдельных колодцах из девяти хорошо стеклянная тарелка на льду в 400 микролитров PBS плюс ингибиторы, передать все глазно-мозговые комплексы в 400 микролитров ледяной PBS плюс ингибиторы декантированы на чистую черную рассечение блюдо. Под чистым рассечением микроскопа используйте прочную вольфрамовую иглу и тонкое лезвие бритвы, чтобы очистить каждый глаз от оптической доли, и использовать смазанные кончики для передачи глазно-мозговых комплексов в пять микролитров PBS плюс ингибиторы в 500-микролитер микроцентрифуг трубки на льду. Затем добавьте в трубку пять микролитров буфера лиза западной ткани и 10 микролитров буфера 2X концентрированного белка.

Для обработки глаз-мозг комплексов для извлечения РНК, носить перчатки, очистить скамейку, микроскоп, рассечение инструментов, и черный рассечение блюд с 70% этанола и RNase обеззараживающих реагентов. После того, как область высохнет, вскрыть в общей сложности от 30 до 40 куколок партиями от шести до восьми. После того, как каждая партия глаз-мозг комплексов были вскрыты, передать глаз мозга комплексов из девяти хорошо блюдо в 400 микролитров свежих, ледяной, нуклеазы свободной PBS на чистой рассечения блюдо, и использовать прочную вольфрамовую иглу и тонкой лезвие бритвы, чтобы чисто вырезать каждый глаз из оптической доли.

Когда все глаза для партии были удалены, передать их в стерильные, RNase-бесплатно микроцентрифуг трубки, и флэш-заморозить образцы в жидком азоте, прежде чем перейти к следующей партии. Пупок глаз легко доступны ткани, которая служит отличной моделью для исследования процессов развития, в том числе те, которые управляют морфогенезом. Примерно через 40 часов после образования пупариума достигается окончательное расположение клеток.

Это идеальный возраст для оценки последствий генетической мутации или измененной экспрессии генов. Например, после эктопического выражения Diap1, основного ингибитора апоптоза, последующее увеличение количества клеток решетки можно сравнить с тем, что наблюдается в контрольной сетчатке. Апоптоз также можно оценить более непосредственно, используя антитела для активации оболочки смерти-1 или с помощью других подходов для обнаружения умирающих клеток.

Западные анализы помарки глазных ликатов могут быть использованы для определения наличия или относительного выражения белков, представляющих интерес, или для сравнения экспрессии белка в различных точках времени развития. Важно отметить, что вскрытие более 60 глаз на генотип или экспериментальное состояние является оптимальным для изоляции достаточно высококачественной РНК. Самое главное помнить, что пупок сетчатки является чрезвычайно хрупким, и большая осторожность должна быть приняты во время его вскрытия, чтобы обеспечить его целостность.