Использование En Face иммунофлуоресценции окрашивания для наблюдения сосудистых эндотелиальных клеток непосредственно
20 августа 2019 г.
Здесь мы представляем протокол для иммунофлуоресценции окрашивания наблюдать эндотелиальных клеток аорты мыши непосредственно. Этот метод полезен при изучении клеточного и молекулярного фенотипа эндотелиальных клеток в различных структурах потока и в развитии атеросклероза.
Этот протокол помогает людям анализировать эндотелиальной морфологии клеток, и выражение молекул в регионах, под различными жидкости стрижки стресса. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает прямую оценку сосудистых эндотелиальных клеток при различном стрессе стрижки жидкости. При выполнении этой процедуры ключевыми шагами являются использование свежеприготовленного параформальдегида и выполнение хорошей перфузии.
Начните эту процедуру с анестезии 12-недельной мыши C57BL/6, как описано в текстовом протоколе. Подтвердите правильную анестезию, аккуратно щипав хвост. Лента лапы мыши к стопке бумажных полотенец, с клейкой лентой.
Поддерживайте кожу мыши типсами и вырежьте кожу ножницами от живота до верхней части грудной клетки. Откройте брюшную полость, ниже грудной клетки, острыми ножницами. Поднимите грудину типсами и разрежьте диафрагму.
Затем отрежьте грудную клетку, чтобы разоблачить грудную полость. Отрежьте вена кавы чуть выше печени с ножницами. Давление пронизывает артериальное дерево в течение пяти минут, с предварительно охлажденным нормальным солевым раствором, содержащим 40 единиц на миллилитр гепарина, через левый желудочек, пока легкие и печень не побледнели.
Затем пролизавиться с предварительно охлажденным 4%paraformaldehyde в PBS в течение четырех минут. Удалить все мышцы, органы и жир, пока аорта подвергается. Поместите мышь под рассечение микроскопа.
Используйте тонкие типсы и пару тонких ножниц, чтобы разоблачить аорту четко под рассекающим микроскопом, и удалить соединительной ткани вдоль аорты, как можно более чисто. Рассекают грудную аорту от сердца до целиакии ствола с помощью тонких ножниц. Поместите аорту в шестициметровую клеточную культуру с помощью PBS.
Разрежьте аорту продольно, сначала вдоль меньшей кривой, а затем используйте микросцисоры, чтобы разрезать три ветви аортальной арки, включая инноту, левую общую сонную артерию, и левую подклавианскую артерию вдоль большей кривой до тех пор, пока не будет выполнен прямой сегмент. Permeabilize аорты с 1%polyoxyethylene октил фенил эфир, в PBS в течение 10 минут. Затем блокируйте аорту с 10%нормальной сывороткой козы в трис-буферном солевом растворе, содержащем 2,5%полисорбат 20 в течение одного часа при комнатной температуре, в 12 хорошо клеточной культуре пластины.
Далее инкубировать аорту в блокирующий буфер, содержащий пять граммов на миллилитр кролика анти-VCAM1, и пять граммов на миллилитр крысы анти-VE-кадхерин, на ночь при четырех градусах по Цельсию. После полоскания образца три раза с стиральным раствором, применять флуоресценции конъюгированных вторичных антител в течение одного часа при комнатной температуре, сохраняя в темном месте. Промыть еще три раза в стиральном растворе.
Counterstain аорты с DAPI в течение 10 минут, сохраняя в темном месте. Затем промыть окрашенные аорты три раза в стиральный раствор. Поместите аорту на крышку скольжения с люменальной поверхности вниз, и переместить его медленно, чтобы антифада монтажа раствор, который ранее был сброшен на крышку скольжения.
Аккуратно растянуть аорту, чтобы сохранить образец плоским. Инвертировать крышку скольжения и положить его на стеклянную горку. Позаботьтесь, чтобы избежать пузырьков воздуха между образцом и стеклом.
Изучите аорту с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Анализ интенсивности цвета различных каналов из нужной области на изображениях en face, с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus. En лица иммунофторесценции окрашивания изображения сосудистых эндотелиальных клеток из мыши аорты показаны.
En лицо иммунофлуоресценции сосудистой клеточной адгезии белка один, и выражение с VE-кадерин в качестве эндотелиального маркера, показаны при различных моделей потока из разных областей мыши аорты. DAPI был также counterstained, чтобы показать ядра клеток для лучшей визуализации. При просмотре стеков под микроскопом эндотелиальные и гладкие мышечные клетки легко отличить по морфологии ядер клеток.
Ядра эндотелиальных клеток имеют овальную форму и больше, чем ядра клеток в форме шпинделя. Выражение ВКАМ-1 было более обильным в регионах с нарушенным потоком, при меньшей кривизны арки аорты, по сравнению с регионами под устойчивым потоком, при большей кривизны арки аорты и на грудной аорте. Здесь области меньшей кривизны аорты мыши обозначены как области d-потока, и большая кривизна и грудной клетки.
При правильной модификации этот метод может быть также применен к анализу проницаемости сосудов, а также к положению макромолекул в эндотелиальной инима клетке.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для прямого наблюдения за эндотелиальными клетками аорты мыши. Этот метод эффективен для анализа клеточного и молекулярного фенотипа данных клеток в условиях различного напряжения сдвига потока, в частности, в связи с развитием атеросклероза.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Биология эндотелиальных клеток
- Исследования атеросклероза
- Методы иммунофлуоресценции
Теоретическое обоснование
- Значение эндотелиальных клеток в биологии сосудов
- Роль напряжения сдвига в функции эндотелия
- Связь между паттернами кровотока и развитием атеросклероза
Используемые методы
- Протокол иммунофлуоресцентного окрашивания
- Мышиная модель (C57BL/6)
- Конфокальная микроскопия для визуализации
Основные результаты
- Прямая оценка эндотелиальных клеток с помощью флуоресцентных маркеров
- Повышенная экспрессия VCAM-1 в зонах нарушенного кровотока
- Четкое различие между морфологией ядер эндотелиальных клеток и гладкомышечных клеток
Выводы
- Данное исследование представляет надежный метод изучения реакций эндотелиальных клеток на гемодинамические силы.
- Полученные результаты имеют важное значение для понимания биологии сосудов и механизмов, лежащих в основе развития атеросклероза.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Прямая визуализация интактных монослоев эндотелия в условиях физиологического напряжения сдвига позволяет снизить механистические риски при исследовании сосудистых мишеней при атеросклерозе. Данный подход повышает прогностическую достоверность валидации мишеней, связывая гемодинамические силы с молекулярными фенотипами in situ. Он представляет собой релевантную с точки зрения заболевания систему для получения патофизиологических данных на ранних этапах без необходимости генетических манипуляций или фармакологического воздействия.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем корреляции нарушений паттернов кровотока с повышением экспрессии VCAM-1 как раннего маркера воспаления.
- Операционная ценность: предоставляет надежный и воспроизводимый метод функциональной валидации мишеней с использованием эндогенных эндотелиальных маркеров, таких как VE-Cadherin.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля препаратов путем выявления молекулярных ответов, которые предшествуют формированию поражений в доклинических моделях атеросклероза.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных количественных данных иммунофлуоресценции, подходящих для высокопроизводительного анализа эндотелиальных фенотипов.
- Масштабируемость: позволяет проводить параллельную оценку нескольких участков аорты при заданных условиях потока, что делает возможным сравнительный скрининг.
- Стандартизация анализа: использование единообразных протоколов перфузии, блокировки и окрашивания для минимизации вариабельности между экспериментами и лабораториями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Позволяет напрямую моделировать раннюю предрасположенность к атеросклерозу путем изучения эндотелиальных ответов в областях, склонных к формированию бляшек.
- Трансляционная преемственность: Связывает гемодинамическую механобиологию с молекулярными показателями, имеющими значение для патологии сосудов человека.
- Снижение рисков при разработке: Обеспечивает механистическое снижение рисков при выборе мишеней путем подтверждения их регуляции в условиях патофизиологического напряжения сдвига перед тестированием эффективности in vivo.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум исследований — от проверки гипотез о мишенях и фенотипического скрининга до доклинической валидации, что особенно актуально для программ, сосредоточенных на изучении сосудистой системы.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез, обеспечивая прямое наблюдение за состояниями активации эндотелия при контролируемом напряжении сдвига.
- Скрининг: Обеспечивает количественные мультиплексные показатели (например, VCAM-1, VE-Cadherin, морфология ядер) для сравнения влияния соединений или генетических факторов на фенотип эндотелия.
- Аналитика: Предоставляет измерения интенсивности с пространственным разрешением, что позволяет проводить статистическое сравнение молекулярной экспрессии в различных областях аорты.
- Трансляционные исследования: Связывает модели потока in vitro с эндотелиальными ответами, подобными in vivo, что повышает прогностическую ценность доклинических исследований.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для фенотипирования сосудов, применимую в многочисленных проектах по изучению атеросклероза, гипертензии или воспаления сосудов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неоднозначность путем установления связи между гемодинамическими силами и конкретными молекулярными фенотипами эндотелия в интактной ткани.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет четко определенных этапов перфузии, фиксации и окрашивания.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) путем подтверждения взаимодействия с мишенью в условиях патофизиологически значимых механических стимулов.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе их регуляции в эндотелиальных фенотипах на ранних стадиях атеросклероза.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области диссекции сосудов мыши, методах перфузии и конфокальной микроскопии.
- Зависимость от наличия оборудования для перфузии, диссекционных микроскопов и лазерных сканирующих конфокальных систем со спектральным разделением (unmixing).
- Необходима стандартизация давления перфузии, температуры фиксатора и титрования антител для всех пользователей и центров.
- Адаптация метода для других сосудистых русел (например, сонных или коронарных артерий) может потребовать оптимизации этапов диссекции и пермеабилизации.
- Метод ограничен конечным анализом; не позволяет проводить динамическую визуализацию эндотелиальных ответов в режиме реального времени при наличии кровотока.
