Биосинтез флавона на флаваноне путем создания одногоршкового биензиматического каскада

Используя этот протокол, мы можем легко производить довольно много флавонолов из флаванонов в одном горшке. Этот метод является трудоемким и экономя времени, высокоэффективным с точки зрения затрат и простым в управлении, поэтому он имеет огромный потенциал индустриализации. Да, этот метод может дать представление об экономическом производстве других вторичных метаболитов, но он нуждается в некоторых изменениях при применении к нему.

Он, как правило, ничего не получают или очень низкий урожай. Мой совет заключается в обработке рекомбинантных ферментов на льду и добавить 10%глицерин в фондовый раствор ферментов. Это потому, что только через визуальную демонстрацию может новая рука понять важные детали и правду, влияющие на успешное выполнение эксперимента.

Сначала подготовь буферы. Сделайте два раза синтетический буфер, растворив соответствующее количество TRIS-базы, аскорбат натрия, альфа-кетоглутаровую кислоту в деионизированную воду, и пипетку соответствующее количество глицерола к раствору. Используйте пипетку, чтобы добавить соляную кислоту, чтобы настроить рН до 7,2, и регулировать объем, добавляя деионизированной воды.

Храните два раза синтетический буфер при четырех градусах по Цельсию для использования в будущем. Затем сделайте 100-х раз бульонный раствор, растворив ферросульфат гептагидрат в деионизированной воде. Сделать фондовый раствор 25 миллимолярского флавоноида путем растворения флавоноида в метаноле, и хранить раствор при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

Наиболее важным шагом является настройка синтетической системы. Чтобы создать синтетическую систему для производства флаванола из флаванона, сначала подготовьте синтетическую систему в двухми миллилитровой трубке в соответствии с реагентами, перечисленными в этой таблице. Поместите открытую трубку в тепловой блок при температуре 40 градусов по Цельсию при температуре 600 об/мин в течение сорока минут.

После этого прекратите реакцию, добавив 10 микролитров уксусной кислоты и 100 микролитров этилового ацетата. Два часа спустя используйте пипетку, чтобы провести верхнюю органическую фазу до 1,5 миллилитровой трубки и поместить трубку в капюшон для сушки воздуха при комнатной температуре. Для выполнения анализа TLC сначала извлекаем трубки из капота и переделываем флаваноидный порошок в 160 микролитров метанола в трубку.

Подготовка подлинных образцов флавоноидов с серийными концентрациями, путем разбавления 25 миллимолярского раствора флавоноидного бульона в метаноле. Загрузите один микролитер образца реакции redissolved, и один микролитер подлинного образца флавоноида, на полиамидовую пластину. Сделай то же самое для других концентраций аутентичных флавоноидов на той же пластине.

Затем в паровой капот положите образец загруженной пластины в хроматографический цилиндр, наполненный растворительной системой. Прикрепите пластину к нижней части цилиндра и запустите пластину в растворительной системе в течение 20 минут. Воздух сушит тарелки при комнатной температуре.

С распылитель бутылку, спрей пластины с 1%ethanolic раствор хлорида алюминия, а затем сушки воздуха снова при комнатной температуре в течение 30 минут. Визуализуй пятна на пластинах под ультрафиолетовым светом на 254 нанометров, и сделать снимки, а затем на компьютере, открыть программное обеспечение ImageJ. Нажмите файл, откройте, чтобы открыть изображение для анализа.

Нажмите на левый самый прямоугольный инструмент выбора в пользовательском интерфейсе ImageJ. Очертуйте рентабельность инвестиций на изображении с помощью мыши и нажмите на нее, чтобы обозначить первую рентабельность инвестиций. Переместите прямоугольный выбор с помощью мыши прямо к следующей рентабельности инвестиций и нажмите два, чтобы обозначить вторую рентабельность инвестиций.

Повторите, чтобы обозначить все другие ROIs, нажав два. Нажмите три, чтобы создать профили участков для всех ИИ, во всплывающем окне. Затем используйте инструмент выбора прямой линии для снижения базовых показателей, чтобы определить закрытую область для каждого пика интереса.

Активируйте инструмент палочки, нажав на соответствующий значок в пользовательском интерфейсе ImageJ. Нажмите внутри пика, чтобы отобразить результаты для всех пиков во всплывающем окне. Далее, в Excel, сюжет серые значения из всплывающего окна против соответствующих концентраций флавоноидов, чтобы сделать TLC на основе стандартной кривой подлинного флавоноида.

Затем рассчитать доходность флавоноида интерес, произведенный в этом протоколе, в соответствии с полученной формулой. Используйте шприц для последовательной обработки каждого образца с помощью фильтров 0,45 микрометра и 0,22 микрометра. Загрузите образцы в систему HPLC-MS через всасывающее сопло и разделите образцы при 30 градусах по Цельсию с помощью столбца C18.

Уните столбец на один миллилитр в минуту градиентом от 10 до 85 градусов ацетилнитного нитрила в воде, и контролировать поглощение элуата от 200 до 800 нанометров. Выполните анализ LC-MS в негативном ионом режиме, с сухим потоком азота 10 литров в минуту при 300 градусах по Цельсию, в оболочке потока газа семь литров в минуту при 250 градусах по Цельсию, и собирать данные с помощью встроенного программного обеспечения. Чтобы извлечь одноволновые хроматографы, откройте программу качественного анализа и нажмите файл, открытый файл datafile.

Выберите файл для анализа в окне открытого файла данных и нажмите кнопку "Открыть файл". Право нажмите мышь в окне результатов хроматограммы, а затем извлечь хроматограммы во всплывающем меню. В списке типов нажмите на другие хроматограммы.

В комбо-коробке детектора выберите DAD1, а затем нажмите кнопку «Хорошо», чтобы отобразить результаты HPLC в окне результатов хроматограммы. Нажмите значок ручной интеграции, пристыкованной к верхней части окна результатов хроматограммы. Нарисуйте базовый уровень для пика, необходимого для ручного интеграционного анализа с помощью мыши.

Нажмите на представление, список пик интеграции, чтобы отобразить результаты. Копировать результаты пиковых областей в Excel, и участок HPLC на основе стандартной кривой подлинного флавоноида против соответствующих концентраций флавоноидов, а затем рассчитать выход флавоноида интерес производится в этом протоколе в соответствии с результирующей формулой. Затем повторите те же процедуры для извлечения одноволновых хроматограмм для анализа данных MS для точной массы флавоноидных соединений.

Нажмите значок выбора диапазона на панели инструментов результатов хроматограммы. Выберите пик интереса. Нажмите кнопку мыши в выбранном диапазоне и нажмите на спектр экстракта MS во всплывающем меню, чтобы отобразить результаты в окне результатов спектра MS.

Чтобы определить, может ли эта система in-vitro использоваться для преобразования флаванона во флавонол, NRN был добавлен в систему. Существовали два новых пятна появились на полиамид TLC пластины. Одно место показало расстояние миграции, аналогичное расстоянию DHK, а другое аналогично расстоянию KMF.

Дальнейший анализ HPLC и LC-MS показал, что новое химическое вещество показало время удержания 12 минут и 20 минут соответственно, в квази-молекулярном иоонном пике M над 287 и 285, которые были идентичны времени DHK и KMF. Чтобы определить, может ли система быть использована для преобразования других флаванонов в соответствующие флавонолы, ERD был добавлен в систему. Два новых пятна на полиамидной пластине TLC отображали расстояние миграции, аналогичное расстоянием DH и QRC соответственно.

Анализы HPLC и LC-MS показали, что эти новые химические вещества выявили время хранения 10 минут и 16 минут соответственно, и квази-молекулярный ионный пик M над 303 и 301, что точно соответствовало времени DH и РК. При подготовке синтетической системы, вы должны добавить фермент, наконец, и добавить сульфат железа второй до последнего. Да, он обеспечивает руководство для экономичного производства других вторичных метаболитов.