Электрофорез ДНК, вместо тиазол оранжевый бромид Ethidium или альтернативных красители
31 марта 2019 г.
Здесь мы представляем протокол тиазол оранжевый для обнаружения ДНК в экспериментах электрофореза геля. Использование тиазол оранжевый позволяет ликвидации бромид ethidium, и флуоресценции обнаружения может быть достигнуто с УФ или синий свет.
Этот протокол является легкой и недорогой альтернативой использованию бромистого этидия для обнаружения ДНК во время электрофореза. Удалив бромид этидия, для обнаружения можно использовать ультрафиолетовый или синий свет. Синий свет не повреждает ДНК, что повышает шансы на успех для экспериментов ниже по течению.
Это действительно легко попробовать это. Вы просто должны заменить бромид этидия в гелях с тиазол оранжевый. Для начала приготовьте 1%мини-гелей, смешивая примерно 0,7 грамма агарозы в 70 миллилитров трис-ацетат-ЭДТА или трис-борат буферов.
Затем растворите тиазол оранжевый в DMSO, чтобы сделать 10,000X фондовый раствор. Хотя не особенно свет чувствительны, хранить тиазол оранжевый в темноте, когда не используется. Для длительного хранения сделайте алициты из смеси тиазол оранжево-DMSO и заморозьте их.
Затем добавьте тиазоловый апельсин в окончательную концентрацию 1,3 микрограмма на миллилитр, и микроволновая печь смесь буфера агарозы и апельсина тиазола растворить агарозу в течение примерно 60 секунд. Налейте смесь агарозы в гель литья аппарат, содержащий соответствующий гребень, и позволяют раствор агарозы затвердеть в гель. Чтобы загрузить гель, сначала поместите гель в электрофорезный аппарат, если его уже нет.
Затем добавьте taE или TBE бегущий буфер, чтобы покрыть поверхность геля. Далее, используя погрузочный краситель, загрузите 10 микролитров образца ДНК. Включите лестницу размеров ДНК для справки.
Прикрепите крышку и электроды, и запустить мини-гель на 100 вольт, пока погрузочный краситель путешествует примерно четыре-семь сантиметров для мини-гель. Если тиазол оранжевый не был применен до литья геля, пятно гель, погрузив его в буфер, содержащий тиазол оранжевый с нежным возбуждением в течение 20 минут или до тех пор, пока полосы полностью обнаружены. Чтобы визуализировать гель с помощью УФ-трансиллюминатора, удалите гель из электрофорезного аппарата и поместите его на УФ-трансиллюминатор.
Чтобы визуализировать гель с помощью синего светового трансиллюминатора или фонарика, поместите гель на синий свет трансиллюминатор или направить синий светодиодный фонарик на гель сверху или снизу. Используйте фильтр выбросов янтаря, чтобы отфильтровать синий свет, что позволяет визуализировать флуоресценцию из ДНК тиазол оранжевых комплексов и для защиты красителей. Для дальнейшего пищеварения или перевязки, вырезать желаемые полосы ДНК из геля и приступить к извлечению ДНК с помощью легко доступны комплекта или протокола.
Выберите соответствующие настройки возбуждения и выбросов в гелеобразующей аппарате. При отсутствии системы визуализации с соответствующими фильтрами поместите янтарный фильтр между камерой и гелем синего света источника возбуждения. Пределы обнаружения аналогичны между бромистым этидием, тиазол-оранжевым и обычным коммерческим красителем ДНК, обнаруживаемым синим светом, при этом предел обнаружения всех трех красителей составляет от одного до двух нанограммов на полосу в мини-геле.
Тиазол оранжевый окрашенных агароза гель ограничения дайджест обнаруживается, когда он возбужденных с УФ или синий свет трансиллюминатора или с синим фонариком света. Хотя тиазол оранжевый, как представляется, менее опасны, чем бромид этидия, стандартные средства индивидуальной защиты, такие как перчатки и очки по-прежнему следует носить.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен простой и недорогой способ замены бромида этидия для детектирования ДНК при гель-электрофорезе. Используя тиазоловый оранжевый, исследователи могут применять либо УФ-свет, либо синий свет для флуоресцентного детектирования, что повышает сохранность ДНК в ходе экспериментов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Молекулярная биология
- Методы электрофореза
Теоретические сведения
- Бромистый этидий является распространенным красителем для ДНК, однако он представляет риск для целостности ДНК.
- Тиазоловый оранжевый представляет собой более безопасную альтернативу для визуализации ДНК.
- Флуоресцентное детектирование может быть осуществлено с помощью безвредного синего света.
- Данный метод экономичен и прост в реализации.
Цель исследования
- Представить протокол детекции ДНК без использования бромистого этидия.
- Продемонстрировать эффективность использования thiazole orange в гель-электрофорезе.
- Осветить преимущества использования синего света для визуализации ДНК.
Используемые методы
- Приготовление 1% мини-гелей с использованием агарозы и соответствующих буферов.
- Замена этидия бромида на тиазоловый оранжевый в гелях.
- Флуоресцентная детекция с использованием УФ- или синего света.
- Оценка целостности ДНК после электрофореза.
Основные результаты
- Тиазоловый оранжевый эффективно окрашивает ДНК при электрофорезе в геле.
- Детекцию можно безопасно проводить с использованием синего света.
- Протокол прост и воспроизводим.
- Последующие эксперименты демонстрируют более высокие показатели успеха благодаря снижению повреждения ДНК.
Выводы
- Тиазоловый оранжевый является жизнеспособной альтернативой бромистому этидию.
- Использование синего света минимизирует повреждение ДНК во время детекции.
- Данный метод повышает достоверность последующих экспериментов в области молекулярной биологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Гель-электрофорез ДНК остается базовым этапом валидации мишеней и разработки анализов, при котором целостность образца напрямую влияет на достоверность последующих результатов. Замена бромистого этидия тиазоловым оранжевым снижает генотоксический риск при сохранении чувствительности детектирования, что способствует более безопасному скринингу соединений и процессам идентификации ведущих соединений. Это позволяет научно-исследовательским группам в биофармацевтике сохранять качество ДНК для клонирования, секвенирования или функциональных анализов без ущерба для пропускной способности или экономической эффективности.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять гипотезы с помощью анализа фрагментов ДНК без внесения артефактов окрашивания, которые могли бы затруднить подтверждение целевого продукта.
- Практическая ценность: совместимость с существующей инфраструктурой визуализации в УФ- или синем свете, что не требует пересмотра протоколов в лабораториях, использующих бромистый этидий.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает количественное определение размера ДНК с пределом обнаружения 1-2 ng/lane, что позволяет проводить точный анализ фрагментов при оценке эффективности клонирования или валидации продуктов ПЦР.
- Практическая ценность: Устраняет необходимость обращения с опасными отходами и соблюдения специальных требований по утилизации, связанных с бромистым этидием, что упрощает соблюдение норм безопасности в лаборатории.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Сохраняет целостность ДНК для последующих этапов, таких как лигирование, трансформация или трансфекция, что повышает вероятность успешного создания конструктов для доклинических моделей.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность визуализации в синем свете, что снижает повреждение образцов под воздействием УФ-излучения и повышает воспроизводимость результатов в повторных экспериментах.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Этот метод вписывается в рабочий процесс биологических исследований, в котором анализ ДНК служит основой для валидации мишени, идентификации соединений-лидеров и разработки доклинических конструкций, особенно при оценке генетических модификаций или результатов скрининга.
- Биология открытий: Обеспечивает точное разделение и определение размера фрагментов ДНК, что позволяет надежно оценивать результаты редактирования генов, целостность плазмид или ПЦР-ампликоны при подтверждении целевых последовательностей.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимую количественную визуализацию полос, необходимую для оценки разнообразия библиотек или подтверждения хитов в анализах на основе нуклеиновых кислот.
- Аналитика: Генерирует сопоставимые данные об интенсивности флуоресценции по всем образцам, что позволяет проводить последовательное сравнение выхода или чистоты ДНК при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Сохраняет функциональность ДНК для использования при трансфекции клеток млекопитающих или производстве вирусных векторов, что критически важно для продвижения кандидатов на стадию доклинических испытаний.
- Корпоративное использование: Представляет собой взаимозаменяемый реагент, который может быть стандартизирован между различными группами и площадками без необходимости повторной квалификации оборудования или программного обеспечения для электрофореза.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет минимизации повреждений ДНК, вызванных красителем, что повышает достоверность данных молекулярной биологии, используемых для оценки мишени.
- Операционная ценность: Использует недорогой, неопасный тиазоловый оранжевый с простыми условиями хранения (аликвотированный замороженный стоковый раствор в DMSO), что снижает затраты на реагенты и требования к технике безопасности.
- Стратегическая ценность: Повышает надежность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет сохранения целостности образцов для последующего секвенирования, клонирования или функциональных анализов.
- Влияние на портфель: Поддерживает продвижение проектов с учетом рисков, гарантируя, что качество данных на основе ДНК соответствует критериям оптимизации ведущих соединений и выбора доклинических кандидатов.
Особенности реализации
- Опыт в области молекулярной биологии по подготовке агарозных гелей и проведению электрофореза.
- Стандартная установка для электрофореза с УФ- или синим трансиллюминатором и янтарным эмиссионным фильтром для детекции.
- Последовательное размораживание и перемешивание замороженных аликвотов тиазолового оранжевого в DMSO для обеспечения равномерного окрашивания.
- Валидация эффективности окрашивания на модельных системах (напр., плазмидной или геномной ДНК) при адаптации к новым типам образцов.
- Ограничение: требуется оптимизация времени окрашивания (20 мин) при использовании метода окрашивания после электрофореза, что добавляет дополнительный этап по сравнению с методами окрашивания при подготовке геля.
