Высокой пропускной силы тяги Микроскопия использованием PDMS показывает доз-зависимые эффекты преобразования фактор роста-я на Эпителиальный-к-мезенхимальный переход
1 июня 2019 г.
Мы представляем высокую пропускную силу силы ассеис изготовлены с силиконовой резины (PDMS). Этот новый ассси подходит для изучения физических изменений в сотрудничности клеток во время различных биологических и биомедицинских процессов и заболеваний. Мы демонстрируем полезность этого метода, измеряя tGF-я зависимое увеличение контрактности во время эпителиального перехода к мезенхимальному.
Моя лаборатория интересуется механобиологией, которая исследует, как клетки оказывают давление и находятся под влиянием механических сил. Одним из способов количественной оценки механобиологии является измерение клеточной сотысячность. В адептовых клетках контрактичность проявляется в силах тяги, оказываемых на клеточный субстрат. Мы количественно эти силы с помощью методологии обычно называют тяги силы микроскопии или TFM. И TFM реализована в широком спектре различных методов, но общий аспект заключается в том, что это довольно серийный и медленный метод лаборатории, как правило, в одном блюде, как этот здесь. Это ограничивает нас в оценке одного населения или состояния за один раз. На протяжении в клеточной культуры была улучшена некоторое время назад, но создание мультиуэлл блюда, и мы думали, не было бы здорово, мы могли бы TFM с той же повышенной пропускной способности и той же эффективности времени и реагентов? И это было наше решение. Таким образом, мы создали 96 хорошо тяги силы блюдо. И это очень похоже на обычные 96 хорошо ткани культуры блюдо, однако с этим блюдом мы можем не только изучить 96 различных условий клеточной культуры, но и количественно их клеток контракту. Это представляет собой гораздо более высокое решение пропускной способности, чем один подход блюдо, что позволяет нам изучить различные условия клеток и контрактильные ответы. Во время метастазирования рака раковые клетки путешествуют от своего основного участка к вторичным участкам, распространяя болезнь в нашем организме. На это метастатическое поведение раковых клеток приходится 90% случаев смерти, связанных с раком. Одним из предлагаемых механизмов эпителиальных раковых клеток для приобретения более мигрирующих и инвазивных фенотипов является эпителиально-мезенхимальный переход, ЭМТ. Во время скорой МТ они становятся более мигрируют и инвазивны, изменяя свое физическое поведение. Чтобы лучше понять эти изменения в физическом поведении, мы используем наш мягкий подложка кремния для измерения изменений в контрактности клеток молочной железы мыши с индукцией ЭМТ TGF-В этом исследовании, мы исследовали, как различные концентрации и инкубационные время TGF-влияния клеток физического поведения. Polydimethylsiloxane является очень совместимой резины с самым низким модул янг около 0,6 килопаскаля. Жесткость этого материала также может быть настроена с использованием различных концентраций перекрестного агента, включая SYLGARD 184.To измеряет механические свойства PDMS мы используем реометр. После смешивания части А и части В PDMS, в соотношении один к одному веса и добавления лечебного средства с указанным процентом веса, загрузите подготовленную партию на реометровую пластину. Убедитесь в том, чтобы загрузить достаточно образца, чтобы полностью покрыть область шпинделя. Важно убедиться, что шпиндель касается образца полностью без свободного пространства осталось на его краю. Любой дополнительный образец следует тщательно подстригать и вытирать с тарелки. Измерьте окончательную модулу хранения и зависимость времени вязкости каждого образца, делая время и частоту зачисток на осцилляторном деформации стрижки 0.5%Newsha'Этот график является одним из примеров теста seq времени, сделав для измерения реологического поведения полидиметилсилоксана с прикладным колеблемым деформацией стрижки 0,5% и температурой 100%
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод высокопроизводительного анализа силы тяги, разработанный с использованием силиконового каучука (PDMS) и предназначенный для изучения физических изменений сократимости клеток в ходе различных биологических процессов. Полезность данного метода продемонстрирована путем измерения TGF-β-зависимого увеличения сократимости при эпителиально-мезенхимальном переходе.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Биомеханика
- Биомедицинская инженерия
Теоретические основы
- Сократимость клеток имеет решающее значение в различных биологических процессах.
- Понимание изменений сократимости может дать представление о механизмах заболеваний.
- Традиционным методам может не хватать пропускной способности и чувствительности.
- PDMS является универсальным материалом для создания аналитических систем.
Цель исследования
- Разработать высокопроизводительный метод измерения сократимости клеток.
- Оценить влияние TGF-β на сократимость в процессе эпителиально-мезенхимального перехода.
- Предоставить надежный метод изучения поведения клеток в различных условиях.
Используемые методы
- Изготовление системы для анализа силы тяги с использованием PDMS.
- Измерение сократимости клеток в ответ на TGF-β.
- Высокопроизводительный анализ для оценки множества образцов.
- Оценка динамики эпителиально-мезенхимального перехода.
Основные результаты
- Успешное измерение изменений сократимости клеток.
- Продемонстрировано TGF-β-зависимое увеличение сократимости.
- Подтверждена эффективность анализа на основе PDMS.
- Получены данные о механизмах процессов клеточного перехода.
Выводы
- Метод анализа тяговой силы на основе PDMS эффективен для изучения сократимости клеток.
- Было подтверждено повышение сократимости в процессе эпителиально-мезенхимального перехода.
- Данный метод может быть применен в различных биологических и биомедицинских исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эта высокопроизводительная платформа микроскопии тяговых сил позволяет проводить количественную оценку сократимости клеток в масштабируемом формате, что способствует снижению механических рисков на ранних этапах поиска. Связывая индуцированный TGF-β эпителиально-мезенхимальный переход с измеримыми биофизическими изменениями, данный метод обеспечивает прогностическую ценность для валидации мишеней в исследованиях фиброза и метастазирования. Система на основе PDMS обеспечивает воспроизводимость и совместимость с существующими многолуночными рабочими процессами, расширяя возможности повторного использования в рамках биологического поиска и разработки методов анализа.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: Позволяет исследовать роль TGF-β как модулятора сократимости клеток в процессе ЭМП, что способствует проверке гипотез о мишенях.
- Операционная ценность: Предоставляет дозозависимые и временно-разрешенные данные о сократимости для определения приоритетности механистических мишеней в путях фиброза и рака.
- Прогностическая ценность: Количественно определяет биофизические фенотипы, связанные с ЭМП, что помогает в доклиническом выборе мишеней и снижении рисков при изучении сигнальных путей.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает количественные, не зависящие от субстрата измерения сократимости для стандартизации анализов при скрининге в области механобиологии.
- Практическая ценность: совместимость с 96-луночными форматами позволяет проводить параллельный скрининг библиотек соединений или доз цитокинов.
- Готовность анализа: использование стабильных инертных субстратов из PDMS с регулируемым модулем (0,4–100 kPa) и неограниченным сроком хранения снижает вариабельность между партиями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает дозу и продолжительность воздействия TGF-β с сократительным выходом, что позволяет создавать доклинические модели ЭМП, согласованные с биомаркерами.
- Механистическое снижение рисков: позволяет оценивать изменения сократимости в качестве функционального показателя в системах, релевантных заболеванию, перед валидацией in vivo.
- Обоснованное продвижение с учетом рисков: поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем сопоставления молекулярного вмешательства с модуляцией биофизического фенотипа.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум процесса поиска лекарств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, обеспечивая биофизические показатели, необходимые для принятия решений на ранних этапах.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о влиянии сигналинга TGF-β на клеточную механику и сократимость.
- Скрининг: Позволяет проводить высокопроизводительную, воспроизводимую количественную оценку сил тяги в многолуночных форматах для анализа зависимости «доза-эффект».
- Аналитика: Позволяет рассчитывать показатели сократимости (величину и распределение силы) для сравнения различных концентраций TGF-β и времени воздействия.
- Трансляционные исследования: Связывает индукцию ЭМП in vitro с измеримыми биомеханическими изменениями, что подтверждает значимость доклинических моделей.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для измерения силы тяги, применимую для различных типов клеток и объектов механобиологии при изучении онкологии и фиброза.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность валидации мишеней за счет уменьшения неоднозначности механобиологических фенотипов.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость за счет использования стандартизированных подложек из PDMS и совместимости с многолуночными планшетами.
- Стратегическая ценность: увеличивает эффективность использования капитала, обеспечивая возможность параллельного тестирования условий и снижая расход реагентов на одну единицу данных.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации мишеней с учетом рисков на основе количественных сдвигов сократимости при патогенных переходах.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, анализом изображений TFM и подготовкой подложек из PDMS.
- Для характеристики подложки требуется реометрия, а для количественного определения силы тяги — флуоресцентная микроскопия.
- Необходимо стандартизировать плотность посева, функционализацию подложки и условия визуализации для всех лунок.
- Адаптация метода для различных типов клеток может потребовать оптимизации жесткости подложки и адгезивных лигандов.
- Практические ограничения включают неравномерность толщины подложки и возможную автофлуоресценцию PDMS при определенных длинах волн.
