Новый протокол для генерации физиологических иммуногенных дендритных клеток

Физиологические дендритные антиген-представляя клетки, называемые PhDC, являются иммунными мастер-переключатели, которые инициируют антиген-специфический иммунитет Т-клеток и толерантности. Эта статья разграничивает эффективный метод для производства PhDC. Клиническое использование дендритных клеток препятствует неиспихиатических методов цитокинов, используемых для их производства.

Наш метод преодолевает эту проблему с помощью эффективной сигнализации тромбоцитов преобразования моноцитов в ДК у людей и мышей. Эти PhDC не зависят от условий цитокинов недоступны in vivo, поэтому они могут генерировать мощные клинические противоопухолевой Т-клеток ответы у людей и мышей с установленным раком. Вид-независимое начало тромбоцитов созревания моноцитов к PhDC имеет широкую экспериментальную применимость.

PhDC позволяет рассечение дендритных клеток физиологии, облегчить индукцию терапевтического противоопухоливого иммунитета к иммуногенным ракам, и предлагают перспективы для персонализированной противомикробной вакцинации. Эта экспериментальная система является новой, и несколько аспектов, таких как покрытие пластиковой камеры, лечение опухолевых клеток с 8-MOP/UVA, условия потока, и высвобождение моноцитов лучше всего визуально представлены. Демонстрацией процедуры будет Ева Робинсон, техник из моей лаборатории.

Для сбора периферических моноядерных клеток крови, сначала создали 15-миллилитровую трубку с четырьмя миллилитров лимфоцитов изоляции среды на пять до 10 мышей кровь. Затем медленно слой крови, собранной из опухолевых мышей на верхней части среды. Спин клеток на 1000-1, 500 раз-G в течение 20 минут, чтобы отделить ПКМК от красных кровяных телец.

В конце центрифугации, собирать верхний слой плазмы, оставляя 0,5 миллилитров, оставшихся выше баффи пальто, и хранить при четырех градусах по Цельсию для более позднего использования. Далее, собирать баффи слой пальто в чистую 15-миллилитровую трубку заполнены PBS до 15 миллилитров, и спина в 250 раз G в стандартной центрифуге культуры ткани в течение 10 минут, чтобы собрать PBMC. В конце центрифугации, тщательно пипетки от супернатанта и Флик трубки повторно гранулы.

Затем добавьте два миллилитров буфера лиза красных кровяных телец ACK в трубку, чтобы удалить оставшиеся эритроциты из PBMC. Инкубировать PBMC на льду в течение 10 минут. Заполните трубку с PBS до 15 миллилитров, и спина вниз на 250-раз-G в стандартной центрифуге культуры тканей в течение 10 минут, чтобы собрать PBMC.

Тщательно пипетка от супернатанта и Флик трубки, чтобы ослабить гранулы. Повторное производство гранул в 300 микролитров FBS. Для подготовки YUMM1.7 опухолевых клеток в группе лечения, сначала повторно использовать гранулы опухолевых клеток в FBS на 2,5 миллиона клеток на 300 микролитров.

С тканью культуры капот свет выключен, добавить 8-methoxypsoralen для окончательной концентрации 100 нанограмм на миллилитр в YUMM1.7 опухолевых клеток подвески. Затем смешайте клетки, оберните контейнер клетки в фольгу и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Чтобы предварительно покрыть пластину культуры тканей 12-хорошо, добавьте один миллилитр FBS к одному хорошо для каждой группы лечения из пяти мышей, и хранить в холодильнике пластины при четырех градусах по Цельсию в течение 20 минут.

Через 20 минут, под капюшоном культуры тканей, удалить FBS из колодцев, и добавить 300 микролитров метамфетамина подвергаются опухолевые клетки на скважину. Затем подвергайте клеточно-содержащую пластину предварительно разогретому ультрафиолетовому источнику света для полного облучения четырех джоулей на квадратный сантиметр. Для сбора 8-methoxypsoralen / UVA-обработанных опухолевых клеток из каждой хорошо, вихрем пластины и пипетки тщательно, чтобы обеспечить полное восстановление клеток.

Для выполнения трансиммунизации пластины проход для каждой группы лечения из пяти мышей, объединить 300 микролитров соответствующих PBMC и 300 микролитров 8-methoxypsoralen / UVA-обработанных опухолевых клеток в 1,5-миллилитровой конической трубки и смешать клетки. Далее откройте вход и выход трубки зажимы пластины TI. Используйте 10-миллилитровый шприц, чтобы заполнить трубку TI с FBS, закрывая зажимы, как трубка заполнена, чтобы сохранить FBS внутри трубки.

Отключите шприц. Поместите наконечник пипетки P1000 надежно в вход пластины TI. Держите пластину под углом 45 градусов и медленно заполните пластину смесью PBMC и опухолевых клеток, избегая пузырьков.

Удалите наконечник пипетки из потребления, прежде чем выпустить поршень пипетки. Верните оставшиеся клетки в коническую трубку с 1,5 миллилитров. Инкубировать заполненные FBS трубки, заполненные клетками ПЛАСТИНЫ TI, и 1,5-миллилитровая коническая трубка, содержащая оставшиеся клетки в инкубаторе культуры тканей при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.

После инкубации отпустите зажимы и опорожните Тюбинг TI гравитацией. Затем вставьте наконечник P1000 пипетки с поршень депрессии в порт пластины, чтобы удалить клетки из пластины TI. Держите пластину под углом 45 градусов и заполните наконечник пипетки P1000.

Поместите клетки обратно в их первоначальную 1,5-миллилитровую коническую трубку. Чтобы запустить пластину TI, подключите выходную трубку к пластине и закреполните пластину TI в систему, запускаемую пластинами. Затем, используя одноми миллилитровый шприц, составить эти 600 микролитров PBMC и смеси опухолевых клеток из 1,5-миллилитровой конической трубки.

Прикрепите шприц к входной трубке с открытым зажимом и медленно заполните, пока жидкость не достигнет конца трубки. Прикрепите свободный конец входной трубки к пластине TI и продолжайте аккуратно загружать оставшийся объем. Закройте входной зажим, когда закончите.

Отсоедините одноми миллилитровый шприц и соедините входную трубу со шприц-насосом. Закрепните выходную трубу до чистой 1,5-миллилитровой конической трубки для сбора клеток. Отрегулируйте скорость потока шприц-насоса до 0,09 миллилитров в минуту.

Наклоните пластину TI примерно на 30 градусов к стороне насоса шприца с помощью платформы TI пластины. Аккуратно отпустите зажим на входной трубе. Запустите шприц насос, внимательно наблюдая, как пластина TI заполняет.

После того, как пластина TI полностью заполнена, наклоните ее примерно на 30 градусов в противоположном направлении, как она опустеет. Когда все клетки в жидкости находятся в 1,5-миллилитровой конической трубки сбора, остановить насос. Чтобы вымыть пластину TI, отсоедините входную трубку от шприц-насоса и соедините ее с одноми миллилитровый шприц, наполненный 600 микролитров FBS.

Заполните до тех пор, пока FBS полностью загружен. Затем отключите шприц и прикрепите трубку к шприц-насосу. Отрегулируйте скорость потока шприц-насоса до 0,49 миллилитров в минуту.

Отпустите входной зажим, и запустить TI пластины, собирая мыть в той же 1,5-миллилитровой конической трубки. Флик или нажмите TI пластины мягко все время, чтобы помочь в отсоединения и eluting любой приверженец клеток, как пластина опорожняется. Отключите коллекцию 1,5-миллилитровую коническую трубку от установки пластины TI.

Закрутьте трубку коллекции в микрофуге на скамейке в 250 раз-G в течение восьми минут и отбросьте супернатант. Для выполнения ночной совместной инкубации PBMC с антигеном, первый resuspend PBMC и гранулы опухолевых клеток в двух миллилитров ясно RPMI дополнены 15%аутологичной сыворотки мыши. Затем клетки пластины в 35-миллиметровой неткани культуры лечение стерильных блюдо, и инкубировать на ночь в стандартных условиях культуры тканей.

На следующий день, тщательно отделить любые клетки адепта от нижней части блюда с тканью культуры скребок. Поверните блюдо во время соскабливания, чтобы обеспечить даже сбор клеток. Соберите клетки в 15-миллилитровую трубку.

Добавьте в блюдо два миллилитров PBS и повторите шаг соскабливания, собирая клетки в ту же трубку. Промыть 35-миллиметровую тарелку одним миллилитром PBS и добавить полоскание в ту же трубку. Спин при 250-времени-G в стандартной центрифуге культуры ткани в течение 10 минут, чтобы собрать клетки.

Тщательно пипетка от супернатанта, а затем Флик трубки повторно гранулы. Терапия показала снижение роста опухоли YUMM1.7 в более чем 100 обработанных против контрольных мышей, как это наблюдается в кумулятивных данных роста опухоли девяти независимых экспериментов, проведенных в течение двух лет. Репрезентативные кривые роста опухоли для отдельных животных в рамках одного эксперимента обеспечивают ощущение изменчивости в системе.

Когда моноциты или тромбоциты истощаются из фракции PBMC, или когда прохождение пластины опущено, терапевтический эффект больше не наблюдается. Лечение является неэффективным в отсутствие либо иммунных клеток или источника антигена, или в присутствии несовпадаемого антигена, таких как опухоли YUMM1.7, обработанные с помощью клеток карциномы толстой кишки MC38. Для иммунизации результат, это также важно, чтобы избежать воздействия PBMC на 8-methoxypsoralen.

Анализ FACS изменения указанных маркеров от соответствующих элементов управления IgG в человеческих CD11c-клеток среди либо недавно изолированных PBMC, TI-обработанных PBMC, TI-обработанных PBMC без прохождения пластины, обедненные тромбоциты до прохождения пластины, или оба вышеперечисленных, показали, что активация DC зависит от наличия тромбоцитов в PBMC, и на прохождение пластины TI. TI-активированных человеческих DCs может эффективно обрабатывать и кросс-настоящее либо пептидных антигенов, или антигены из целых 8-methoxypsoralen подвергаются человеческие опухолевые клетки, чтобы активировать человека антиген-специфических Т-клеток линий в пробирке анализы в TI-и тромбоцитов зависимой образом. Специфика реакций Т-клеток зависит от источника обработанных антигенов.

При индуцировании противоопихолявого иммунитета, апоптоз каждой линии раковых клеток должен быть титрирован, чтобы максимизировать иммуногенность. Поскольку индуцированный иммунитет будет специфичен для иммунизации антигенов, будет возможно детальное вскрытие каждой системы. Каждый экспериментальный или клинический рак, и каждый антимикробный ответ, будет однозначно информативным.

Каждый отдельный рак человека имеет свой собственный массив опухолевых антигенов. PhDC выполняет необходимую сортировку и представление опухолевых антигенов, не требуя их предварительной лабораторной идентификации. Пожалуйста, имейте в виду, что 8-MOP и UVA свет канцерогенов.

Используйте соответствующее защитное оборудование и следуйте процедурам безопасности при обработке 8-MOP и при работе с источниками света UVA.