Исследование изменений в Caecum микробиоты после травматического повреждения головного мозга у мышей
19 сентября 2019 г.
Представлено здесь протокол, чтобы вызвать диффузную черепно-мозговую травму с помощью боковой жидкости ударные устройства следуют сбор содержания caecum для анализа кишечного микробиома.
Одновременность и линии взаимодействия между мозгом и микрофлорой кишечника остаются неизвестными. Используйте этот метод, изменения в микрофлоре кишечника после черепно-мозговой травмы у мышей могут быть рассмотрены. Основным преимуществом этой техники является то, что она относительно проста и эффективна.
Демонстрацией процедуры будет Wendong You, аспирант из моей лаборатории. Для черепно-мозговой травмы индукции, подтвердить отсутствие реакции на боль в крайнем случае в анестезированной мыши, и применять мазь на глазах животного. После бритья, дезинфицировать открытые кожи головы с 70%этанола до инцизии кожи головы в sagittal плоскости.
Используя типсы, втягивайте разрез с обеих сторон и слегка отделяйте периостеум. Используйте маркер, чтобы нарисовать круг диаметром три миллиметра на правой теменной области черепа в двух миллиметрах от средней линии. Используйте электрическую дрель, чтобы тщательно проникнуть в череп, не повреждая дуру.
Удалите костной лоскут, чтобы разоблачить трехмиллиметровое костное окно и поместите пластиковую канюлю травмы над краниотомией. После цементирования канюли к черепу с помощью зубного акрила, используйте пятими миллилитровый шприц, чтобы заполнить канюлю стерильным 0,9% нормального солевого раствора, заботясь, чтобы избежать пузырьков. Включите осциллоскоп и усилитель.
Подтвердите, что трубка высокого давления боковой жидкости ударных травмы устройства не является свободным от пузырьков воздуха, и доставить около 10 импульсов испытания, пока устройство дает устойчивый сигнал. Отрегулируйте угол стартового положения маятника, чтобы достичь интенсивности пульса около двух стандартных атмосфер и подключить канюлю травмы к боковой жидкости ударных травмы устройства. Потяните спусковой крючок, чтобы освободить маятник, вызывая черепно-мозговую травму.
Затем получить и передать импульс dura через всю закрытую, заполненную жидкостью трубчатую систему. После индукции черепно-мозговой травмы удалите канюлю и шов разреза. Затем поместите мышь на грелку с мониторингом, пока она не амбулаторно, прежде чем вернуть животное в свою домашнюю клетку с объявлением libitum доступ к пище и воде.
В указанных экспериментальных точках времени, подвергать кишечник в соответствии со стандартными протоколами и использовать атравматические типсы, чтобы мягко отделить caecum от других кишечных трактов. Когда ткань была обнаружена, вырезать caecum с острыми ножницами и вручную извлечь caecum содержимое на стерильную повязку. Затем перенесите содержимое в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку при температуре минус 80 градусов по Цельсию до анализа микробиома.
16S рекомбинантное секвенирование ДНК демонстрирует снижение разнообразия микробиоты caecum у мышей через три дня после черепно-мозговой травмы, с наиболее распространенной таксой в caecum содержание фиктивных и черепно-мозговых травм групп показано на рисунке. Кроме того, неметрическое, многомерное масштабирование выявляет изменения в составе микробиоты caecum после черепно-мозговой травмы. Не забудьте сохранить дура нетронутыми при бурении черепа, и быть нежным при поиске и отделении caecum от других кишечных путей.
После этой процедуры, гематоксилин и эозин окрашивания и анализа могут быть выполнять для изучения гистологических изменений и воспалительных реакций в желудочно-кишечных трактах после черепно-мозговой травмы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен протокол индукции диффузной черепно-мозговой травмы (ЧМТ) у мышей с использованием устройства для латерального жидкостного перкуссионного удара. После нанесения травмы в исследовании изучаются изменения в микробиоте кишечника путем сбора содержимого слепой кишки для последующего анализа. Данный подход направлен на выяснение взаимодействий между травмой головного мозга и составом микробиоты кишечника.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Анализ микробиома
- Исследования черепно-мозговых травм
Теоретическая часть
- Понимание взаимосвязи между мозгом и микробиотой кишечника имеет решающее значение в исследованиях ЧМТ.
- Современные знания о том, как ЧМТ влияет на микробиоту кишечника, ограничены.
- Использование мышей в качестве модельного организма позволяет обеспечить контролируемые условия эксперимента.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол индуцирования ЧМТ и анализа последующих изменений в микробиоме кишечника.
- Исследовать потенциальные корреляции между неврологическим повреждением и разнообразием микробиоты кишечника.
- Получить представление о влиянии ЧМТ на общее состояние здоровья и взаимодействия в микробиоме.
Используемые методы
- Для индукции ЧМТ у анестезированных мышей использовали устройство для латерального жидкостного удара.
- Были проведены тщательные хирургические манипуляции, включая прокол черепа и имплантацию канюли.
- После получения травмы содержимое слепой кишки собирали для анализа микробиома и хранили надлежащим образом.
- Для определения изменений в разнообразии и составе микробиоты применяли секвенирование 16S рДНК.
Основные результаты
- Анализ показал снижение разнообразия микробиоты слепой кишки в течение трех дней после ЧМТ.
- Неметрическое многомерное шкалирование продемонстрировало значительные сдвиги в составе микробиоты после травмы.
- Исследование подчеркивает необходимость соблюдения осторожности при работе с тканями и поддержании стерильных условий.
Выводы
- В данном исследовании разработана методология изучения оси «кишечник-мозг» в контексте ЧМТ.
- Результаты показывают, что ЧМТ может приводить к нарушению микробиоты кишечника, что может иметь последствия для процесса восстановления.
- Расширение знаний о взаимодействии между кишечником и мозгом может лечь в основу будущих терапевтических стратегий лечения ЧМТ.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет снизить неопределенность в изучении механизмов оси «микробиота—кишечник—мозг» при исследованиях черепно-мозговой травмы, предоставляя воспроизводимую модель для оценки изменений микробиома после травмы. Он способствует валидации мишеней и поиску биомаркеров путем установления связи между неврологической травмой и количественными сдвигами в составе микробиоты слепой кишки. Данный подход повышает прогностическую достоверность доклинических исследований за счет стандартизации процессов индукции ЧМТ и отбора проб микробиома.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять гипотезы об оси «кишечник-мозг» путем измерения изменений разнообразия микробиоты после контролируемого индуцирования ЧМТ.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированную хирургическую процедуру и метод отбора проб для последовательного сбора микробиоты слепой кишки во всех экспериментальных группах.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает получение количественных данных секвенирования 16S рДНК для профилирования изменений в составе микробиоты в образцах слепой кишки.
- Практическая ценность: Устанавливает воспроизводимый рабочий процесс анализа микробиома, который может быть интегрирован в конвейеры скрининга терапевтических средств, воздействующих на кишечник.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обосновывает моделирование систем, имеющих значение для изучения заболевания, путем установления корреляции между тяжестью ЧМТ и изменениями микробиома на мышиной модели.
- Практическая ценность: Позволяет осуществлять лонгитюдный мониторинг изменений микробиоты для принятия обоснованных решений о продвижении доклинических программ с учетом рисков.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод связывает биологический поиск и доклиническую валидацию путем стандартизации индукции ЧМТ и анализа микробиома кишечника для снижения рисков при подборе мишеней.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез о взаимодействиях между микробиотой, кишечником и мозгом посредством контролируемого повреждения и профилирования микробиома.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных образцов микробиоты слепой кишки, подходящих для последующего секвенирования 16S и анализа разнообразия.
- Аналитика: позволяет проводить количественное сравнение микробного состава с помощью неметрического многомерного шкалирования и показателей разнообразия.
- Трансляционные исследования: связывают модели неврологических повреждений с биомаркерами микробиома для обеспечения непрерывности доклинических исследований.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для изучения модуляции оси кишечник-мозг в моделях неврологических заболеваний.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в исследованиях оси «кишечник-мозг», обеспечивая количественные показатели микробиоты после ЧМТ.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированных протоколов хирургического вмешательства, отбора проб и секвенирования.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем связывания моделей ЧМТ с биомаркерными признаками микробиома.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации соединений, направленных на взаимодействие между кишечником и мозгом при восстановлении после ЧМТ, с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения хирургических процедур на мышах и навыков стерильного обращения с тканями.
- Зависит от наличия устройств для нанесения латеральной жидкостной перкуссионной травмы и инфраструктуры для секвенирования 16S рДНК.
- Необходима межгрупповая стандартизация между специалистами по нейронаукам и анализу микробиома.
- Требует учета особенностей адаптации при отборе проб из слепой кишки для различных линий мышей или моделей повреждения.
- Ограничено необходимостью соблюдения правил асептики при препарировании тканей кишечника для предотвращения контаминации.
