Метод, свободный от ферментов для изоляции и расширения человеческих адипосальных стволовых клеток
16 декабря 2019 г.
Этот протокол обеспечивает без ферментов метод для изоляции мезенхимальных стволовых клеток от абдоминопластики и липоаспиробразцовых образцов с помощью метода explant. Отсутствие суровых ферментов или этапов центрифугации обеспечивает клинически значимые стволовые клетки, которые могут быть использованы для исследований в пробирке или переданы обратно в клинику.
Этот протокол обеспечивает простой экономически эффективный способ изоляции ASCs без использования суровых ферментов или центрифугации шаги, которые могут изменить фенотип клетки и поведение. Отсутствие резких шагов дает меньше манипулируемых клеток, чем те, которые изолированы с помощью ферментов и центрифугации, сводя к минимуму вопросы о том, являются ли экспериментальные наблюдения артефактом метода изоляции. Этот метод explant может генерировать клинические соответствующие ASCs, которые будут введены в пациента для лечения различных заболеваний или расширить в жизни позволить себе научно-исследовательских приложений.
Трудно в полной мере объяснить метод заминки на словах. Визуальная демонстрация может служить другим ученым хлопот научиться распадать ткани сами. Подобные методы экспланта могут быть использованы для изоляции других популяций MSCs, таких как из пупочной ткани.
Чтобы измельчить образцы абдоминопластики, сначала перенесите ткань на крышку стерильной 100-миллиметровой пластины. Затем используйте стерильную иглу, чтобы держать кусок ткани на месте и использовать стерильный скальпель, чтобы разрезать ткань на менее чем один миллиметр штук. Перенесите ткань в свежую трубку и инвертировать или встряхнуть образец пять-шесть раз, чтобы обеспечить смешивание всех слоев.
Затем, с помощью стерильного шпателя, перенесите от 2,5 до 5 миллилитров ткани на 100-миллиметровую вакуумную газовую плазму, обработанную пластиной культуры тканей. Измерьте объем образца, вылив в свежую центрифугу трубку. Затем добавьте эквивалентный объем средств культуры тканей к пластине и аккуратно закружить пластину, чтобы смешать содержимое.
Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в пять процентов углекислого газа, пока достаточное количество клеток не будут видны на основании пластины. После того, как достаточное количество клеток отмечается на пластине или через семь дней, в зависимости от того, раньше, удалить все оставшиеся части ткани. Далее, культура ASCs в ткани культуры средств массовой информации, пока они не достигнут 70% слияния или до тех пор, пока кластеры становятся плотными, в какой момент клетки должны быть прохождение.
Аккуратно промойте пластину 1X фосфатом буферного солевого раствора. Чтобы трипсинизировать адепт клетки, аспирировать фосфат буфера солевого раствора, добавить один миллилитр трипсина дополняется 0,25%EDTA к каждой пластине и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Добавьте небольшое количество мультимедиа к пластине, чтобы отключить трипсин.
Затем аккуратно пипетки средства массовой информации трипсина из верхней части пластины вниз, потеря любых слабо прикрепленных клеток от пластины. Чтобы посеять клетки, сначала добавьте мультимедиа в тарелку. Затем добавьте клетки в dropwise образом, а затем вихрем пластины для обеспечения равномерного распределения по всей тарелке.
После трех проходов, приступить к потоку цитометрии и дифференциации анализов. После трех отрывков, изолированные ASCs из липоаспирата и абдоминопластики образцов было установлено, что морфология MSC и фенотип, похожий на изолированных ASCs после энзиматической пищеварения. Как и другие MSCs, эксплант изолированные ASCs являются отрицательными для CD45 и положительным для CD73, CD90 и CD105.
При заминки ткани, площадь поверхности каждого куска должна быть достаточно большой для ASCs мигрировать из ткани. Это фундаментальные стволовые клетки, которые могут быть использованы для широкого спектра применений. Изолированные ASCs могут быть использованы для любого приложения вниз по течению, in vivo или in vitro.
Обзор
В данном протоколе описывается безферментный метод выделения стволовых клеток из жировой ткани (ASCs) из образцов абдоминопластики и липоаспирата с использованием метода эксплантации. Такой подход сводит к минимуму манипуляции с клетками, обеспечивая получение клинически значимых стволовых клеток, подходящих для различных применений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Регенеративная медицина
- Методы изоляции клеток
Теоретические основы
- Традиционные методы выделения МСК часто включают использование агрессивных ферментов и центрифугирование.
- Эти методы могут изменять фенотип и поведение клеток.
- Метод эксплантатов представляет собой более щадящую альтернативу.
- Визуальные демонстрации могут помочь в понимании процесса измельчения ткани.
Цель исследования
- Разработать экономически эффективный и простой метод выделения ASCs.
- Снизить риск возникновения артефактов в экспериментальных наблюдениях, вызванных жесткими методами выделения.
- Получить клинически значимые ASCs для терапевтического применения.
Используемые методы
- Измельченную ткань, полученную при абдоминопластике, культивируют в планшете для культивирования тканей.
- Клетки инкубируют при 37°C в среде с CO2.
- После достаточного роста клеток оставшиеся фрагменты ткани удаляют.
- Клетки подвергают пассированию и характеризуют по маркерам стволовых клеток.
Основные результаты
- Изолированные МСКЖ демонстрируют морфологию и фенотип, сходные с клетками, полученными путем ферментативного переваривания.
- МСКЖ, выделенные эксплантационным методом, отрицательны по CD45 и положительны по CD73, CD90 и CD105.
- Данный метод позволяет получить клетки, подвергшиеся меньшему количеству манипуляций, что повышает достоверность экспериментов.
- МСКЖ могут быть использованы для различных последующих приложений, как in vivo, так и in vitro.
Выводы
- Метод эксплантата является жизнеспособной альтернативой для выделения ASCs.
- Эта методика лучше сохраняет характеристики клеток по сравнению с традиционными методами.
- Выделенные ASCs обладают широким потенциалом для использования в исследованиях и клинической практике.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Этот метод выделения без применения ферментов решает одну из ключевых проблем регенеративной медицины: получение клинически значимых мезенхимальных стволовых клеток без внесения артефактов, возникающих при жесткой ферментативной или механической обработке. Сохраняя нативный фенотип и функцию клеток, данный подход повышает прогностическую достоверность в последующих приложениях, таких как моделирование заболеваний и терапевтический скрининг. Метод поддерживает рабочие процессы раннего поиска, где снижение биологических рисков и валидация мишеней зависят от надежных источников клеток с минимальным уровнем манипуляций.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Первичное выявление и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с использованием стволовых клеток, полученных из жировой ткани, с сохранением их мультипотентности и профилей поверхностных маркеров.
- Практическая ценность: снижает вариативность результатов экспериментов за счет исключения фермента-индуцированных фенотипических изменений.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет получения менее модифицированных клеток для анализов по валидации мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: получение стволовых клеток из жировой ткани, подходящих для стандартизированных анализов in vitro, требующих стабильных мезенхимальных фенотипов.
- Практическая ценность: упрощение подготовки к анализу за счет экспансии методом эксплантации, которая позволяет сохранить экспрессию CD73, CD90 и CD105.
- Масштабируемость: обеспечение воспроизводимого производства клеток для скрининга соединений и изучения механизмов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает получение клинически значимого источника клеток, соответствующего задачам регенеративной медицины.
- Доклиническая модель: позволяет получать стволовые клетки из жировой ткани для систем, моделирующих заболевания, без воздействия ксеногенных ферментов.
- Снижение механических рисков: уменьшает вероятность возникновения артефактов изоляции, которые могли бы повлиять на оценку дифференцировки или иммуномодулирующей функции.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от первоначального выделения стволовых клеток до доклинической валидации, поддерживая рабочие процессы, в которых целостность источника клеток влияет на надежность данных и принятие решений о целесообразности дальнейшего проведения исследований.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез, предоставляя стволовые клетки, производные из жировой ткани, с нативной морфологией и фенотипом.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные, готовые к экспансии клетки для аналитических платформ, требующих характеристик мезенхимальных стромальных клеток.
- Аналитика: позволяет проводить проточную цитометрию и анализы на дифференцировку после трех пассажей для подтверждения идентичности стволовых клеток.
- Трансляционные исследования: связывает этап изоляции с терапевтическим потенциалом за счет сохранения клинически значимых свойств клеток.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую, безферментную платформу для получения стволовых клеток, производных из жировой ткани, для использования в различных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов за счет минимизации артефактов, вызванных изоляцией, в экспериментах со стволовыми клетками.
- Практическая ценность: предлагает экономичный и простой протокол, не зависящий от дорогостоящих ферментов или центрифугирования.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки за счет повышения достоверности результатов клеточных анализов.
- Влияние на портфель проектов: поддерживает продвижение проектов с учетом рисков, обеспечивая получение надежных мезенхимальных стволовых клеток для доклинической оценки.
Особенности реализации
- Требуется соблюдение правил асептики и наличие базового оборудования для культивирования тканей, необходимого для механического измельчения и культивирования эксплантатов.
- Необходимы стерильные инструменты, включая скальпели, иглы и шпатели, для подготовки тканей.
- Требуются стандартизированные условия инкубации при 37°C и 5% CO2 для оптимального роста клеток.
- Предусматривается ручной пассаж в зависимости от степени конфлюэнтности или плотности кластеров после первоначального удаления ткани.
- Для подтверждения фенотипа после изоляции используются проточная цитометрия и анализы на дифференцировку.
