20,357 Views
•
07:21 min
•
June 23, 2019
DOI:
ВИЧ неизлечим из-за его сохранения в клеточных и анатомических резервуарах. Этот метод позволяет оценку резервуара ВИЧ иммунных клеток, изолированных из легких. Этот метод позволяет изоляции легочных слизистых Т-клеток и альвеолярных макрофагов из жидкости BAL для дальнейшей фенотипической или вирусологической оценки в качестве клеточных резервуаров ВИЧ.
Понимание биологии альвеолярных макрофагов и CD4-положительных Т-клеток и их вклад в резервуар для ВИЧ может привести к важному пониманию проблем, стоящих перед лечением ВИЧ. Изоляция первичных макрофагов от BAL может быть применена в различных других областях исследований, включая воспалительные или инфекционные заболевания легких, такие как астма и туберкулез. После получения жидкости BAL от пациента человека в соответствии со стандартными протоколами, вихрь жидкости в оригинальной трубке сбора перед передачей образца в 50-миллилитровую трубку в биобезопасности кабинета.
Если жидкость кажется очень мутной или загрязненной нитей ткани, фильтровать образец через 70-микрометровый фильтр нейлоновой сетки в новую 50-миллилитровую трубку. После центрифугации перенесите супернатант в новую 50-миллилитровую трубку и используйте наконечник пипетки, чтобы аккуратно разбить гранулы, содержащие целые клетки BAL. Повторное использование гранул в один миллилитр RPMI 1640 среды и добавить один миллилитр зарезервированных supernatant каждого из 10 1,5-миллилитров микроцентрифуг труб.
Добавьте 10-миллилитровые алициты оставшегося супернатанта в 15-миллилитровые конические трубки и поместите все образцы супернатанта в хранилище по температуре минус 80 градусов по Цельсию. Разбавить подвеску гранулы в 10 миллилитров среды на каждые 25 миллилитров оригинального образца и собирать клетки BAL центрифугации. Затем повторно посовечите гранулы в один миллилитр среды, дополненный 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота, или FBS, для подсчета.
Для сортировки целых BAL и периферических моноядерных клеток крови, добавить пять раз 10 к пяти клеткам к каждому из двух пяти-миллилитрового круглого дна полистирола труб на подмножество для необложенных и жизнеспособности окрашенных компенсации контроля и добавить остальную часть каждого подмножества образца в один пятими миллилитров трубки на образец. Соберите клетки путем центрифугации и повторно использовать контрольные гранулы в 100 микролитров PBS на трубку на льду, пока они не будут использованы. Resuspend гранулы клеток для сортировки в 250 микролитров один из 20 разбавления рецепторов Fc блокирование буфера в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию, чтобы заблокировать любые неспецифические связывания.
В конце блокирующей инкубации добавьте соответствующий коктейль антител, представляющий интерес для дополнительной часовой инкубации при четырех градусах цельсия. В конце первичной инкубации антител добавьте по миллилитр PBS в каждую трубку для центрифугации и повторно посовестит гранулы в 250 микролитров буфера сортировки на льду, защищенном от света до сортировки. Чтобы подготовить компенсационный контроль, добавьте по три капли каждой из антимошейных иммуноглобулиных каппа компенсационных бусин и отрицательный контроль компенсации шариков на один миллилитр PBS в микроцентрифуг трубки и передать 100 микролитров шарикового раствора для каждого образца, которые будут использоваться для компенсации.
Добавьте один микролитер каждого антитела в коктейле к каждой отдельной трубке, содержащей бисер, и добавьте один микролитер пятна жизнеспособности к каждой трубке контроля компенсации пятен жизнеспособности. Через 20 минут при четырех градусах Цельсия защищены от света, мыть образцы с одним миллилитром PBS на трубку и повторно гранулы в 250 микролитров свежего PBS на трубку. Загрузите образец управления всей ячейкой BAL на цитометр потока и навейте матрицу компенсации.
Следующая загрузка образца трубки и сортировать клетки под низким давлением, gating исключить шум, включить живые и CD45-положительные клетки, а также исключить дублеты. В пределах большей популяции миелоидов сортируют двойные положительные клетки CD206 и CD169 как альвеолярные макрофаги. В пределах меньшей популяции лимфоцитов изолируйте CD3-положительные клетки и сортируйте однопоймятные популяции CD4 и CD8.
Сортировать образец моноядерных клеток периферической крови, ворота, чтобы исключить шум и дублеты и включить живые CD45-положительные клетки, как попродемонстрировано. После gating на CD3, ворота CD3-отрицательные, CD14-положительные клетки для сортировки одно-положительных моноцитов и ворота CD3-положительных, CD4, и CD8-положительных клеток для сортировки обоих одно-положительных популяций. При подсчете образца whole-BAL можно визуализировать различные типы клеток, включая более крупные, круглые макрофаги и меньшие круглые лимфоциты.
Макрофаги являются наиболее распространенным типом клеток в жидкости BAL, что составляет около 85% клеток в легких некурящих. Эти клетки обогащаются у курильщиков до точки кажущейся почти эксклюзивной и, как правило, увеличиваются примерно на 40% по сравнению с макрофагами, наблюдаемыми у некурящих. Маркеры, используемые для сортировки альвеолярных макрофагов из образцов жидкости BAL, были выбраны на основе ранее описанных фенотипов альвеолярных макрофагов, таких как маннозный рецептор CD206, который присутствует на фагоцитарных клетках и рецепторе sialoadhesin CD169.
После их изоляции альвеолярные макрофаги и другие типы клеток могут быть использованы для иммунофенотипинга путем цитометрии потока, иммунологических функциональных анализов или количественной оценки резервуара сверхчувствительным ПЦР. Этот метод обеспечивает доступ к высоко чистой ткани резидентов макрофагов, которые исторически были трудно достичь, что позволяет ранее недостижимое исследование значительной популяции иммунных клеток.
Мы описываем метод обработки бронхоальвеолярной жидкости для лаважа и соответствующей периферической крови хронически ВИЧ-инфицированных лиц на антиретровирусной терапии для оценки легочных резервуаров ВИЧ. Эти методы приводят к приобретению высокочистых CD4 Т-клеток и альвеолярных макрофагов, которые впоследствии могут быть использованы для иммунофенотипирования и количественных показателей ДНК/РНК с помощью сверхчувствительной полимеразной цепной реакции.
Read Article
Цитировать это СТАТЬЯ
Salahuddin, S., Thomson, E., Méziane, O., Farnos, O., Pagliuzza, A., Chomont, N., Olivenstein, R., Costiniuk, C., Jenabian, M. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. J. Vis. Exp. (148), e59427, doi:10.3791/59427 (2019).
Copy