Обработка бронхоальвеолярной жидкости и совмещенных крови для альвеолярного макрофага и CD4- Т-клеточного иммунофенотипирования и оценки водохранилища ВИЧ

ВИЧ неизлечим из-за его сохранения в клеточных и анатомических резервуарах. Этот метод позволяет оценку резервуара ВИЧ иммунных клеток, изолированных из легких. Этот метод позволяет изоляции легочных слизистых Т-клеток и альвеолярных макрофагов из жидкости BAL для дальнейшей фенотипической или вирусологической оценки в качестве клеточных резервуаров ВИЧ.

Понимание биологии альвеолярных макрофагов и CD4-положительных Т-клеток и их вклад в резервуар для ВИЧ может привести к важному пониманию проблем, стоящих перед лечением ВИЧ. Изоляция первичных макрофагов от BAL может быть применена в различных других областях исследований, включая воспалительные или инфекционные заболевания легких, такие как астма и туберкулез. После получения жидкости BAL от пациента человека в соответствии со стандартными протоколами, вихрь жидкости в оригинальной трубке сбора перед передачей образца в 50-миллилитровую трубку в биобезопасности кабинета.

Если жидкость кажется очень мутной или загрязненной нитей ткани, фильтровать образец через 70-микрометровый фильтр нейлоновой сетки в новую 50-миллилитровую трубку. После центрифугации перенесите супернатант в новую 50-миллилитровую трубку и используйте наконечник пипетки, чтобы аккуратно разбить гранулы, содержащие целые клетки BAL. Повторное использование гранул в один миллилитр RPMI 1640 среды и добавить один миллилитр зарезервированных supernatant каждого из 10 1,5-миллилитров микроцентрифуг труб.

Добавьте 10-миллилитровые алициты оставшегося супернатанта в 15-миллилитровые конические трубки и поместите все образцы супернатанта в хранилище по температуре минус 80 градусов по Цельсию. Разбавить подвеску гранулы в 10 миллилитров среды на каждые 25 миллилитров оригинального образца и собирать клетки BAL центрифугации. Затем повторно посовечите гранулы в один миллилитр среды, дополненный 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота, или FBS, для подсчета.

Для сортировки целых BAL и периферических моноядерных клеток крови, добавить пять раз 10 к пяти клеткам к каждому из двух пяти-миллилитрового круглого дна полистирола труб на подмножество для необложенных и жизнеспособности окрашенных компенсации контроля и добавить остальную часть каждого подмножества образца в один пятими миллилитров трубки на образец. Соберите клетки путем центрифугации и повторно использовать контрольные гранулы в 100 микролитров PBS на трубку на льду, пока они не будут использованы. Resuspend гранулы клеток для сортировки в 250 микролитров один из 20 разбавления рецепторов Fc блокирование буфера в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию, чтобы заблокировать любые неспецифические связывания.

В конце блокирующей инкубации добавьте соответствующий коктейль антител, представляющий интерес для дополнительной часовой инкубации при четырех градусах цельсия. В конце первичной инкубации антител добавьте по миллилитр PBS в каждую трубку для центрифугации и повторно посовестит гранулы в 250 микролитров буфера сортировки на льду, защищенном от света до сортировки. Чтобы подготовить компенсационный контроль, добавьте по три капли каждой из антимошейных иммуноглобулиных каппа компенсационных бусин и отрицательный контроль компенсации шариков на один миллилитр PBS в микроцентрифуг трубки и передать 100 микролитров шарикового раствора для каждого образца, которые будут использоваться для компенсации.

Добавьте один микролитер каждого антитела в коктейле к каждой отдельной трубке, содержащей бисер, и добавьте один микролитер пятна жизнеспособности к каждой трубке контроля компенсации пятен жизнеспособности. Через 20 минут при четырех градусах Цельсия защищены от света, мыть образцы с одним миллилитром PBS на трубку и повторно гранулы в 250 микролитров свежего PBS на трубку. Загрузите образец управления всей ячейкой BAL на цитометр потока и навейте матрицу компенсации.

Следующая загрузка образца трубки и сортировать клетки под низким давлением, gating исключить шум, включить живые и CD45-положительные клетки, а также исключить дублеты. В пределах большей популяции миелоидов сортируют двойные положительные клетки CD206 и CD169 как альвеолярные макрофаги. В пределах меньшей популяции лимфоцитов изолируйте CD3-положительные клетки и сортируйте однопоймятные популяции CD4 и CD8.

Сортировать образец моноядерных клеток периферической крови, ворота, чтобы исключить шум и дублеты и включить живые CD45-положительные клетки, как попродемонстрировано. После gating на CD3, ворота CD3-отрицательные, CD14-положительные клетки для сортировки одно-положительных моноцитов и ворота CD3-положительных, CD4, и CD8-положительных клеток для сортировки обоих одно-положительных популяций. При подсчете образца whole-BAL можно визуализировать различные типы клеток, включая более крупные, круглые макрофаги и меньшие круглые лимфоциты.

Макрофаги являются наиболее распространенным типом клеток в жидкости BAL, что составляет около 85% клеток в легких некурящих. Эти клетки обогащаются у курильщиков до точки кажущейся почти эксклюзивной и, как правило, увеличиваются примерно на 40% по сравнению с макрофагами, наблюдаемыми у некурящих. Маркеры, используемые для сортировки альвеолярных макрофагов из образцов жидкости BAL, были выбраны на основе ранее описанных фенотипов альвеолярных макрофагов, таких как маннозный рецептор CD206, который присутствует на фагоцитарных клетках и рецепторе sialoadhesin CD169.

После их изоляции альвеолярные макрофаги и другие типы клеток могут быть использованы для иммунофенотипинга путем цитометрии потока, иммунологических функциональных анализов или количественной оценки резервуара сверхчувствительным ПЦР. Этот метод обеспечивает доступ к высоко чистой ткани резидентов макрофагов, которые исторически были трудно достичь, что позволяет ранее недостижимое исследование значительной популяции иммунных клеток.