Технология CRISPR/Cas9 в восстановлении экспрессии дистрофинов в iPSC-производных мышечных прародителях

Duchenne является мышечной дистрофии вызывает преждевременное исчерпание клеток мышечного прародителя. Это одна из самых тяжелых мышечных дистрофий. Для содействия функциональной регенерации мышц, мы используем CRISPR/ Cas9-опосредованное редактирование генов для восстановления экспрессии дистрофина в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных клеток мышечного прародителя клеток.

Редактирование генов CRISPR-Cas9 может восстановить экспрессию генов дистрофина. Аутологичные клетки-предшественники мышц iPSC могут пополнить поры стволовых клеток, восстановить повреждения и предотвратить дальнейшие осложнения в ДМД, не вызывая иммунного ответа. Различные агенты iPS-клеток в миогенные клетки-предшественники снижают риск повторного генезиса опухоли в клетках iPS.

Несколько методов лечения, которые сочетают в себе аутологичные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки полученных клеток мышечного прародителя с CRISPR-Cas9-опосредовано генетической коррекции являются перспективными Duchenne мышечной дистрофии стратегии лечения. Эта технология может быть использована для лечения многих врожденных заболеваний путем генетического редактирования аутологичные стволовые клетки, в том числе сердца, мозга и болезней крови. Мы показали, демонстрация этого подхода может предоставить читателям опыт в обработке перепрограммирования клеток и редактирования генов, который остается проблемой.

Под перевернутым микроскопом изучите колонии инфицированных эмбриональных стволовых клеток мыши. Отметь колонии в нижней части блюда маркером самоутверживающегося объекта. Нанесите смазанные кольца клонирования, чтобы покрыть отмеченные колонии клеток.

Добавьте 100 микролитров 0.05%Trypsin-EDTA к каждому клонированию кольца и поместите пластину в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Затем перенесите переваренные клетки со 100-микролитровой пипеткой на 48-колодец культуры пластин, содержащих 250 миллилитров среды роста МЕС. Инкубировать клетки в 37 градусов по Цельсию инкубатор с 5%Carbon Dioxide и 85%humidity.

Когда они читают 70%слияние, выберите скважины с хорошо выращенными клетками и добавьте 250 миллилитров раствора TVP, чтобы переварить в течение 30 минут. Затем перенесите клеточную культуру из каждого колодец в шестисемейметровое блюдо. Повторите применение клонирования колец и инкубации в течение нескольких раз, пока не будут получены однородные клоны в форме общежития.

Теперь переварите подготовленные iPSCs мыши, добавив один миллилитр решения TVP. Передача клеточной культуры в 24-хорошо пластины покрыты фибронектин и желатин и инкубировать при 37 градусов по Цельсию с 5%Углекислый диоксид. После того, как клетки достигнут 50%-ного слияния, переключитесь на 500 микролитров свежей культуры среды, содержащей восемь микрограмм на миллилитр полибрена.

Затем добавьте 100 микролитров раствора лентивирусных частиц в iPSCs мыши. Инкубировать клетки в течение трех дней при 37 градусах по Цельсию с 5%Углекислый газ. Затем определите минимальную концентрацию Бластицидина и гигромицина B, которая составляет половину скорости убийства в течение 24 часов.

Добавьте в клетки средства массовой информации 2,5 микрограмма на миллилитр Blasticidin и 100 микрограмм на миллилитр гигромицин B, подождите три дня и выберите клетки, которые остаются приверженцами в качестве стабиливных инфицированных клеток. Дайджест выбранной мыши iPSCs с 0,5 миллилитров раствора TVP, каждый хорошо в новой пластине 24-колодец, и инкубировать клетки в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию с 5%Carbon Dioxide. Затем пипетка iPSCs в одиночные клетки и подсчитать клетки с камерой подсчета клеток.

Выберите около 150 переваренных одиночных клеток и разбавите средой МЭС в 10-сантиметровое блюдо, культуру при 37 градусах Цельсия с 5%Carbon Dioxide. Примерно через 10 дней, под перевернутым микроскопом, используйте 10 микролитров стерильных пипеток советы, чтобы выбрать одиночные колонии и передать каждую колонию в 50 микролитров раствора TVP в 96-хорошо пластины. Дайджест при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут.

Надежный ручной сбор клонирования имеет решающее значение для успеха сбора CRISPR / Cas9-редактировать индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Затем перенесите и разделите переваренные клетки из каждого хорошо в другой две пластины культуры 96-колодец. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию до 70%-ного слияния.

С клеточной колонии на 70% слияния, удалить средний в 96-хорошо пластины. Добавьте 25 микролитров реагента Lysis, содержащего 1%Proteinase K раствор для каждой хорошо и передать лизат на другой 96-хорошо ПЦР пластины. Печать пластины ПЦР с клеевыми уплотнениями и инкубировать пластину в тепловой циклер при 55 градусов по Цельсию в течение 30 минут, а затем при 95 градусах по Цельсию в течение 45 минут, чтобы подонизить клетки и денатурации Proteinase K.Then, в трубке ПЦР, добавить два микролитров лизата, 10 микролитров 2x ДНК полимеразы Premix, 7 микролитров DNase-бесплатной воды , и один микролитер DMD Exon23 грунтовки.

Запустите реакцию ПЦР в соответствии с рукописью. Затем загрузите реакцию ПЦР, поставляемую с 2,2 микролитров погрузочного буфера на 2%агарозный гель. Вы запустите гель на 100 до 150 вольт в течение 30 минут и проверить гель под ультрафиолетовым светом.

В этом протоколе, два руководства РНК, что фланг мутант Exon23 были разработаны. После cas9-опосредованного двойного мель перерывов и не гомологичный конец присоединения, мутант Exon23 был удален, что позволяет усеченной, но функциональной производства дистрофина. Чтобы избежать утечки трипсина раствор, мы должны применять смазку равномерно в нижней части колец.

Сочетание редактирования генома CRISPR/Cas9 с прикреплённой системой активации MyoD обеспечивает безопасную, осуществимую и эффективную стратегию аутологичной трансплантации у пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна с базальными клетками-предшественниками восстановления генов.