Шаблон-Triggered Окислительный взрыв и рассады Ингибирование роста Анализы в Arabidopsis талиана

Эти анализы могут быть использованы для оценки и сравнения иммунных выходов различных генотипов растений. Основным преимуществом этих методов является то, что они быстры, надежны и используют общее лабораторное оборудование. Для анализа ингибирования роста, саженцы того же размера и возраста должны быть пересажены и полностью смыты сухим перед взвешиванием, чтобы ограничить изменение.

На четыре-пять недель после прорастания, использовать резкий четырехмиллиметровый пунш биопсии, чтобы удалить один лист диска на растение Arabidopsis, избегая среднего и быть осторожным, чтобы ограничить ранение. Соберите диски в отдельные скважины неиспользованной 96-хорошо люминометрической пластины, содержащей 100 микролитров двойной дистиллированной воды на скважину, адаксиальной стороны вверх, чтобы предотвратить высыхание. При оценке нескольких elicitors, удалить второй лист диска из одного и того же листа для каждого elicitor лечения, и покрыть пластину крышкой, чтобы лист дисков восстановить ночь при комнатной температуре.

На следующее утро установите параметры считыватель микропластинок до 1000-миллисекундного времени интеграции за двухминутные интервалы в течение 40-60-минутного периода для захвата динамического окислительного всплеска. Далее, используйте многоканальный пипетку, чтобы заменить воду в каждой колодец с 100 микролитров свежеприготовленного раствора реакции, включая контроль, никакую реакцию разгора для каждого генотипа для оценки базальной реакции уровней кислорода при отсутствии вызвали. Затем немедленно измерьте излучение света для всех длин волн в видимом спектре на считыватель микроплюсов.

В течение четырех дней после прорастания, загрузить каждый колодец 48-хорошо пластины с 500 микролитров MS среды дополняется разбавления пептида elicitor. Затем используйте стерильные типсы, чтобы тщательно пересадить шесть-восемь саженцев одного размера, возраста и генотипа на каждое разбавление пептида, заботясь о том, чтобы не было повреждений рассады или поломки корня и чтобы корень погружался в среду. Когда все саженцы были помойки, печать пластин с Micropore ленты, и место растений в стандартных условиях короткий день в течение восьми до 12 дней.

Чтобы определить процентное торможение роста, сделайте фотографию, чтобы визуально зафиксировать ингибирование роста, прежде чем тщательно удалить саженцы из каждой хорошо. Затем, мазок корни на бумажное полотенце, чтобы высохнуть, и взвесить каждый рассады в аналитическом масштабе. В этом репрезентативном эксперименте мутантные растения с гиперактивной иммунной сигнализацией продемонстрировали более высокий кумулятивный и средний окислительный всплеск по сравнению с растениями арабидопсиса дикого типа, в то время как мутантные растения с нарушениями иммунной сигнализации показали снижение окислительного всплеска в концентрациях от 10 до 1000 наномолярных.

Ожидаемые различия в ингибировании роста рассады также можно различить между всеми генотипами, выращенными в 100 и 1000 наномолярных пептидных концентрациях. Когда они выращивались в разбавлении пептида 1000 наномолеров, мутанты с гиперактивной иммунной сигнализацией были заметно меньше, чем растения дикого типа, выращенные в тех же условиях, в то время как мутанты с ослабленной иммунной сигнализацией проявляли слабое торможение роста по отношению к растениям дикого типа. Эти методы дают доказательства раннего и позднего иммунного ответа.

Для разграничения этих путей можно использовать ряд других методов, включая анализы киназы MAP, экспрессию генов, вызванных патогенами, и анализы инфекций. Эти методы были модифицированы для использования в крупномасштабных экранах, которые успешно определили патогенные рецепторы белков и ряд других сигнальных компонентов.