Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий

Эти протоколы помогут любому исследователю включить использование линий клеток Drosophila для привода или дополнения их исследовательской повестки дня. Большинство, если не все культуры клеток Drosophila оживить, размножаться, и крио-сохранить хорошо при работе в соответствии с этими руководящими принципами. После вытирания рабочей поверхности ламинарного потока капот с 70% этанола, обойтись пять миллилитров соответствующей среде в 25 сантиметров в квадрате Т-колбу.

Протрите контейнер замороженной клеточной линии 70%этанолом и осторожно ослабьте и опечатайте крышку. Используя пипетку Pasteur, перенесите один миллилитр среды комнатной температуры из колбы в крио-флакон и аккуратно перемешайте, чтобы разморозить замороженные клетки. Заботясь о том, чтобы подвеска клетки не переполнялась, перенесите весь объем талой клеточной подвески в колбу и прополощите крио-флакон свежей средой.

Позвольте клеткам осесть на дне колбы, по крайней мере два часа в 25 градусов по Цельсию инкубатора. Не возвращайм замороженные клетки, которые были упакованы для путешествия обратно в морозильную камеру минус 80 градусов по Цельсию в течение длительного периода времени или в жидкий азот. Вместо этого оттаивать клетки как можно скорее.

Подтвердив вложение под световым микроскопом, аккуратно замените супернатант пятью миллилитров свежей среды, прежде чем вернуть колбу в инкубатор. Кроме того, после оттаивания, передача подвески клетки в 15 миллилитров конической трубки для центрифугации и повторно приостановить гранулы в пять миллилитров свежей среды перед посевом в колбу Т-25, как только что продемонстрировали. Чтобы определить, готовы ли клетки к прохождению, изучите морфологию и слияние культуры под микроскопом.

Учитывая плотность клеток и удвоение времени, в последний раз клетки были суб-культурных, и любые признаки загрязнения микроорганизмов в культуре. Если культура представляется весьма сотрясающимся, используйте десять миллилитров супернатанта культуры, чтобы аккуратно выбить клетки из дна пластины культуры и определить плотность клеток, подсчитав количество жизнеспособных клеток в полученной одноклеточной подвеске. Суб-культура клеток, если плотность клеток составляет от пяти до десяти раз десять до шестой клетки на миллилитр в соответствующей среде.

Добавьте по крайней мере один раз десять к шестой клетки на миллилитр концентрации в новой пластине культуры для достижения желаемой плотности посева клеток. Затем накройте и обозначить пластины с оператором инициалы, дата, соотношение сплит, плотность посевных клеток, идентификатор линии клеток, средний, проход номер, и любые средние дополнения, такие как антибиотики, и поместите пластины в пластиковый контейнер для их дальнейшей инкубации в 25 градусов по Цельсию инкубатор. Чтобы выбить клетки-адепты из 100-миллиметрового культурного дна, сначала перенесите все супернатанты в стерильную колбу и промойте клетки с медленным добавлением одного миллилитра 0,05%трипсина ЭДТА.

Аккуратно вихрем, чтобы убедиться, что трипсин решение охватывает всю поверхность роста, прежде чем отказаться от решения. Затем аккуратно добавьте от одного до двух миллилитров свежего 0,05%трипсина EDTA к пластине и поместите пластину в инкубатор 25 градусов по Цельсию в течение трех-десяти минут. Когда клеточный слой можно наблюдать отсоединения и скольжения от растущей поверхности, остановить трипсин деятельности с добавлением девяти миллилитров сохраненных supernatant и смешать подвеску клетки тщательно разъединить клетки сгустки.

Когда все клетки будут выбиты, растущая поверхность будет ясной. Чтобы вручную подсчитать клетки с помощью слайда подсчета клеток Neubauer, сначала протрите поверхность слайда гемоцитометра и накройте скольжение 70% алкоголя. После смешивания добавьте 15 микролитров клеток в каждый рифленый край гемоцитометра, чтобы заполнить обе камеры.

Подвеска ячейки будет втянута в счетную камеру капиллярным действием. Используя цель 10x микроскопа, подсчитайте от 100 до 200 ячеек в пределах одной миллиметровой площади в квадрате в середине сетки, связанной параллельными линиями. Затем повторите перечисление со второй камерой и используйте среднее значение двух подсчетов для определения плотности клеток в соответствии с формулой.

Для крио-сохранения крио-сохранения линии drosophila повторно приостанавливайте клеточные гранулы в объеме замораживания среды, что приведет к окончательной плотности клеток по крайней мере в четыре раза от десяти до седьмого клетки на миллилитр. Добавьте соответствующий объем крио-защиты, диметилсульфсид или DMSO, в падение подвески клетки таким образом, чтобы окончательная концентрация DMSO составила 10% и аккуратно смешивала подвес клетки. Затем аккуратно добавьте 0,5 миллилитров алициты клеточной суспензии в предварительно помеченные крио-флаконы и поместите крио-флаконы в замораживающий контейнер, наполненный изопропанолом.

Затем перенесите замораживающий контейнер в морозильную камеру минус 80 градусов по Цельсию в течение ночи, чтобы температура крио-флаконов медленно опускаться до температуры морозильной камеры. Далее, быстро перенося крио-флаконы на рысы для вставки в канистру с жидким азотом. Кроме того, перенесите замороженные крио-флаконы в предварительно охлажденое замораживание коробки и храните замороженные крио-флаконы в жидкой фазе азотной морозильной камеры.

Слияние клеточной линии можно определить с помощью светового микроскопа. Быстро растущие клеточные линии, которые достигают слияния рано должны быть прохождение регулярно, до двух раз в неделю. В отличие от этого, медленно растущие клетки могут быть пролет по крайней мере один раз в две недели или дольше, хотя эти клетки должны быть накормлены свежей среде каждую неделю.

Клеточные линии, полученные из различных источников тканей, отличаются по морфологии, свойствам присоединения, требованиям к средствам массовой информации и времени удвоения. Для количественных экспериментов, подсчет клеток имеет важное значение. Клетки можно пересчитать с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика частиц.

Слияние клеток является визуальным руководством, когда субкультуры для опытного оператора. Тем не менее, подсчет клеток приводит к предсказуемому графику субкульирования и облегчает выявление аномалий роста. Будьте осторожны и используйте соответствующее защитное снаряжение при работе с жидким азотом.