Визуализация белка киназы активность в голову фиксированной вести мышей, используя в Vivo двухфотонная флуоресценция Пожизненная микроскопия изображений
7 июня 2019 г.
8.1K просмотров
Процедура представлена для визуализации белка киназы деятельности в голову фиксированной, ведя мышей. Улучшенный a-kinase репортер активности, tAKAR, выражается в корковых нейронов и сделал доступным для визуализации через окно черепа. Двухфотонная флуоресценция визуализации микроскопии используется для визуализации деятельности PKA in vivo во время принудительного передвижения.
Наш метод использует новый белок киназы датчик называется целевой киназы деятельности репортер альфа, или tAKAR
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлена методика визуализации активности протеинкиназы А (PKA) у мышей с фиксированной головой в процессе поведения с использованием усовершенствованного репортера активности PKA — tAKARα. Репортер экспрессируется в нейронах коры головного мозга и позволяет проводить визуализацию через краниальное окно с помощью двухфотонной микроскопии с определением времени жизни флуоресценции во время локомоции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Методы визуализации
- Протеинкиназный сигналинг
Теоретические сведения
- Протеинкиназа А играет ключевую роль в нейронной сигнализации и пластичности.
- Понимание активности PKA in vivo может дать представление о поведенческих механизмах.
- Мыши с фиксированной головой позволяют наблюдать за поведением при контролируемых внешних переменных.
- Предыдущие методы визуализации имеют ограничения, которые данное исследование стремится преодолеть.
Цель исследования
- Визуализация активности PKA в мозге мышей в процессе локомоции.
- Использование передового метода визуализации для изучения динамики передачи сигналов в головном мозге.
- Совершенствование существующих методов визуализации активности киназ в живых животных.
Используемые методы
- Использование двухфотонной микроскопии с визуализацией времени жизни флуоресценции в качестве основной платформы для получения изображений.
- Основная биологическая модель предполагает экспрессию репортера tAKARα в кортикальных нейронах мышей с фиксацией головы.
- Мышам подвергают принудительному передвижению для изучения изменений активности PKA.
- Визуализация проводится через краниальное окно для обеспечения наблюдений в режиме реального времени.
Основные результаты
- В данном исследовании успешно реализована визуализация и мониторинг активности PKA in vivo, что позволило продемонстрировать динамику клеточной сигнализации во время поведенческих реакций.
- Наблюдаемые изменения активности PKA коррелируют с локомоцией, что подчеркивает механистическую роль PKA в поведении.
- Результаты свидетельствуют о значительных методологических улучшениях по сравнению с предыдущими методами визуализации.
Выводы
- В данном исследовании представлен новый подход к визуализации активности PKA, позволяющий лучше понять нейронную сигнализацию во время поведенческих реакций.
- Полученные результаты имеют важное значение для будущих исследований нейронных механизмов и пластичности.
- В целом, представленные методологические усовершенствования могут способствовать развитию исследований в области поведенческой нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Каковы преимущества использования мышей с фиксацией головы для визуализации PKA?
Фиксация головы мышей позволяет точно контролировать условия эксперимента, обеспечивая при этом возможность изучения нейронной активности во время естественного поведения, например, при локомоции.
Каким образом репортер tAKARα экспрессируется у мышей?
Репортер tAKARα экспрессируется в кортикальных нейронах, что позволяет в режиме реального времени визуализировать активность PKA во время выполнения поведенческих задач.
Какие типы данных можно получить с помощью этого метода визуализации?
Метод предоставляет данные о динамике активности PKA, что позволяет исследователям соотносить активность киназы с конкретными формами поведения и нейрональными ответами.
Можно ли адаптировать этот метод для визуализации других типов киназ?
Да, метод визуализации и дизайн репортера могут быть модифицированы для изучения различных киназ, что расширяет область его применения на различные сигнальные пути в нейробиологии.
Каковы ограничения данного метода визуализации?
Ограничения могут включать потенциальное влияние других путей клеточной сигнализации и необходимость хирургических процедур для имплантации краниальных окон.
Каким образом двухфотонная микроскопия с визуализацией времени жизни флуоресценции улучшает результаты наблюдений?
Двухфотонная микроскопия обеспечивает более глубокое проникновение в ткани и меньшее фотоповреждение, что позволяет детально визуализировать динамические клеточные процессы in vivo.
Какое значение имеют полученные результаты для поведенческой нейробиологии?
Полученные результаты позволяют лучше понять роль PKA в нейронной сигнализации во время поведенческих актов, что может повлиять на будущие исследования механизмов обучения и памяти.
Практическая значимость для промышленности
Визуализация динамики внутриклеточной сигнализации у животных в процессе поведения позволяет восполнить пробел между молекулярными механизмами и поведенческими фенотипами, что является критически важным этапом валидации мишеней при разработке препаратов для ЦНС. Данный метод обеспечивает мониторинг активности PKA — конвергентного узла для множества нейромодуляторных путей — в режиме реального времени с разрешением до одной клетки во время определенных форм поведения, что позволяет снизить механистические риски для мишеней, находящихся выше cAMP-сигналинга. Путем корреляции активности киназы с локомоцией у мышей с фиксацией головы данный подход повышает прогностическую уверенность в связывании с мишенью и модуляции сигнального пути, что служит основанием для принятия ранних решений о целесообразности продолжения разработки в нейропсихиатрических лекарственных программах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации активности PKA в качестве индикатора нейромодуляторной сигнализации GPCR в определенных популяциях нейронов.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней в интактных нейронных цепях во время поведения, что снижает механистическую неоднозначность при выборе мишени.
- Прогностическая ценность: Способствует оптимизации портфеля разработок путем установления связи между модуляцией мишени и измеримыми изменениями активности киназы в соответствующих поведенческих состояниях.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем (кортикальных нейронов, экспрессирующих tAKARα) для последующего скрининга соединений против нейромодуляторных мишеней.
- Количественные показатели: Получение данных FLIM на основе FRET, что обеспечивает стандартизированное и воспроизводимое измерение изменений активности PKA в ответ на фармакологические воздействия.
- Масштабируемость: Хроническое краниальное окно и фиксация головы позволяют проводить многократные сеансы визуализации, что способствует лонгитюдной оценке влияния соединений на динамику сигналинга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Применимо для изучения нарушения регуляции PKA в моделях нейропсихиатрических расстройств, характеризующихся нарушением нейромодулирующей сигнализации.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает связь между этапом валидации мишеней и доклиническим тестированием эффективности за счет поддержания согласованного считывания активности пути на всех стадиях.
- Оптимизация разработки с учетом рисков: Позволяет на ранних этапах оценить, взаимодействуют ли исследуемые соединения с мишенями и модулируют ли они нижестоящую сигнализацию у животных в условиях поведения, что служит основой для выбора дозы и определения биомаркеров, основанных на механизме действия.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум поиска лекарственных средств — от проверки гипотез относительно мишеней и идентификации перспективных соединений-лидеров до доклинической валидации, обеспечивая получение данных о механизмах действия, которые позволяют принимать обоснованные решения о переходе на каждый следующий этап.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез путем визуализации изменений активности PKA в ответ на высвобождение нейромодуляторов или манипуляции с рецепторами во время поведенческих актов.
- Скрининг: позволяет подготовить анализ для оценки влияния соединений на передачу сигналов cAMP/PKA в нейронных сетях с клеточным разрешением.
- Аналитика: обеспечивает получение количественных измерений FRET на основе FLIM, что позволяет сравнивать динамику сигналинга при различных условиях, генотипах или вариантах терапии.
- Трансляционные исследования: связывает результаты с доклинической работой, предоставляя интерпретируемый показатель активации сигнального пути, который может быть использован в стратегиях поиска биомаркеров.
- Повторное использование в масштабах предприятия: создает универсальную платформу для изучения множества нейромодуляторных мишеней, конвергирующих на PKA, применимую для различных областей мозга и поведенческих парадигм.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в механизме действия мишени посредством прямой визуализации активности киназы как функционального показателя модуляции сигнального пути.
- Операционная ценность: стандартизирует измерение внутриклеточной сигнализации с помощью генетически кодируемых сенсоров и FLIM, снижая вариабельность при оценке путей передачи сигнала.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), связывая взаимодействие с мишенью с изменениями в нижестоящей сигнализации в соответствующих поведенческих контекстах.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации соединений с учетом рисков на основе их способности модулировать активность PKA у животных в процессе поведенческих актов, что снижает вероятность неудач на поздних стадиях из-за отсутствия модуляции целевого пути.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области доставки вирусных векторов или электропорации in utero для экспрессии генетически кодируемых сенсоров в нейронах.
- Необходима инфраструктура для двухфотонной микроскопии с визуализацией времени жизни флуоресценции, а также опыт сбора и анализа данных FLIM.
- Требуются стандартизированные протоколы фиксации головы, поведенческого обучения и содержания хронического окна для обеспечения воспроизводимости результатов в различных исследованиях.
- При применении метода к различным областям мозга или поведенческим тестам, помимо локомоции, необходимо учитывать особенности адаптации методики.
- Практические ограничения включают сложность хирургического вмешательства и возможную вариабельность уровней экспрессии сенсоров, которую необходимо контролировать для проведения количественных сравнений.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Почему проверка нулевой гипотезы имеет значение для валидации мишени при визуализации активности PKA?
Проверка нулевой гипотезы позволяет определить, являются ли наблюдаемые изменения активности PKA во время поведения статистически значимыми, а не результатом случайных колебаний, что обеспечивает строгие доказательства взаимодействия с мишенью и модуляции пути в доклинических исследованиях.
Как изоляция независимых переменных вписывается в процесс разработки исследований по визуализации PKA?
Изоляция независимых переменных, таких как высвобождение конкретных нейромодуляторов или активация рецепторов, позволяет исследователям связать изменения активности PKA с определенными мишенями, что способствует снижению механистических рисков на ранних этапах поиска лекарственных средств.
Какие измерения количественных зависимых переменных позволяют оценить активность PKA у мышей в условиях поведенческих тестов?
Изменения FRET, измеренные с помощью двухфотонного FLIM, обеспечивают количественную оценку динамики активности PKA, что позволяет сопоставить её с поведенческими состояниями и фармакологическими воздействиями.
Почему требования к воспроизводимости важны для межфункционального взаимодействия в рабочих процессах визуализации PKA?
Репликация обеспечивает согласованность измерений активности PKA между животными, сессиями и лабораториями, что крайне важно для надежного обмена данными между группами фундаментальных, доклинических и трансляционных исследований.
Какие возможности статистического анализа необходимы перед внедрением метода PKA FLIM-визуализации в процесс поиска и разработки лекарственных средств?
Для извлечения значимых выводов из наборов данных визуализации требуются возможности анализа временных рядов данных FRET, сравнения распределений в различных условиях и моделирования взаимосвязей между активностью киназы и поведением.
Chapters in this video
0:04
Title
1:06
Motorized Treadmill Construction
3:22
In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging (2pFLIM) Microscopy
6:29
2pFLIM Image Analysis
8:38
Results: Representative 2pFLIM Data Quantification and Targeted A-Kinase Activity-reporter-alpha (t-AKAR-alpha) Tracking
9:29
Conclusion
