Name: Генотипирование морского анемона во время раннего развития (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Узнайте метод генотипирования морского анемона Nematostella vectensis на стадии гаструляции без гибели эмбриона. Этот подход позволяет идентифицировать мутантов рано в онтогенезе для анализа постэмбриональных фенотипов.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы благодарим анонимных рецензентов за комментарии к более ранней версии рукописи, которая улучшила рукопись. Эта работа была поддержана за счет средств Университета Арканзаса.

1. Индукция нереста, экстракорпоральное оплодотворение и де-желе
<ol><li>Поддерживать Nematostella vectensis в морской воде с соленостью 12 частей на тысячу (ppt) в темноте при 16 градусах Цельсия, кормя Артемию ежедневно.</li>
	<li>За день до индукции нереста поместите животных в температурно-легкий инкубатор. Программа инкубатора так, что животные подвергаются воздействию 8 ч света при 25 градусах Цельсия. Дополнительно: Накормить небольшой кусочек (1 мм3) устрицы для отдельных животных, прежде чем поместить их в инкубатор для повышения нереста.</li>
	<li>Оставьте животных в инкубаторе на 1 ч при 16 градусах Цельсия.</li>
	<li>Удалите животных из инкубатора и оставьте их на скамейке со светом при комнатной температуре (RT), чтобы нерест. Нерест обычно происходит в течение следующих 1,5-2 ч.</li>
	<li>Если самцы и женщины находятся в отдельных контейнерах, поместите пакеты яйцеклеток из женского контейнера в контейнер, содержащий сперму, с помощью передаваемых пипеток, кончик которой разрезается, чтобы увеличить отверстие так, чтобы яйца не повреждались механическим стрессом во время механического стресса Передачи. Разрешить яйца, которые будут оплодотворены, оставив их в мужской контейнер, по крайней мере 15 мин.</li>
	<li>Де-желе яйцо пакеты в морской воде, содержащей 3% цистеин (pH 7.4) на чашку Петри или в 15 мл трубки. Аккуратно агитировать на шейкере в течение 12 мин.</li>
	<li>Используйте пластиковый пипетка, чтобы разбить комки и продолжать агитировать еще 2-3 мин, пока полностью де-jellied.</li>
	<li>Удалите цистеин, заменив средства массовой информации пресной морской водой, по крайней мере 5x.</li>
	<li>Храните оплодотворенные яйца на стеклянной чашке Петри при 16 градусах цельсия или РТ.</li>
</ol>2. Хирургическое удаление асоральной ткани из эмбриона гастрита
<ol><li>Подготовьте буфер экстракции ДНК, состоящий из 10 мм Tris-HCl (pH 8), 50 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 и 1 мг/мл протеиназы K. Использование 20 мл буфера экстракции на эмбрион. Хорошо перемешать путем вихря и aliquot буфера в ПЦР труб.</li>
	<li>Растворите 1% агарозы в морской воде и вылейте ее в чашку Петри, чтобы покрыть дно. Охладить на скамейке, чтобы сделать гель кровать. Налейте пресную морскую воду, чтобы покрыть гель кровать в чашке Петри.</li>
	<li>Передача 24 ч после оплодотворения (hpf) эмбрионов (ранней до середины гастральной стадии) в чашку Петри, содержащую гелевой кроватьа агарозы.</li>
	<li>Вставьте вольфрамовую иглу в держатель иглы и стерилизовать путем погружения кончика иглы в спирт (70% или выше) и размещение его в огне, чтобы сжечь алкоголь.</li>
	<li>Под рассекающим микроскопом (при 20x до 40x увеличении) используйте вольфрамовую иглу, чтобы уберечься от агарозной кровати, удалив кусок поверхности агарозы размером с эмбрион, которым можно манипулировать, и поместите эмбрион на депрессию с ее боковой стороны лицом вниз для того, чтобы ограничить движение эмбриона для микрохирургии.</li>
	<li>Используйте вольфрамовую иглу, чтобы хирургическим путем вырезать кусок аборальной ткани, расположенный напротив устного бластопорального отверстия. Асоральный от одной трети до одной четверти эмбриональной ткани вдоль устно-асоральной оси, как правило, достаточно.</li>
	<li>Используйте пипетку P20 для переноса изолированной абораальной ткани (в йт;2 мл) в трубку ПЦР, содержащую 20 мл буфера экстракции ДНК.</li>
	<li>Перенесите послеоперационный эмбрион в колодец, содержащий не менее 500 мл пресной морской воды в 24- или 96-хорошо пластины.</li>
	<li>Повторите шаги 2.4-2.8 для количества эмбрионов по мере необходимости.</li>
	<li>Поместите хорошо пластины, содержащие послеоперационные эмбрионы в инкубаторе на 16 градусов по Цельсию или RT до генотипирования не будет завершена.</li>
</ol>3. Геномная экстракция ДНК и генотипирование ПЦР
<ol><li>Кратко вращайте пЦР-трубки, содержащие буфер экстракции ДНК и изолированные эмбриональные ткани с помощью мини-центрифуги (например, при 2680 х г на 10 с).</li>
	<li>Для извлечения геномной ДНК из отдельных эмбрионов, инкубировать ПЦР трубки при 55 кв. C в течение 3 ч. Вихрь в течение 30 с каждые 30 минут для обеспечения распада клеточных скоплений и повышения лизисклеток.</li>
	<li>Инкубировать пЦР трубки при 95 градусах по Цельсию в течение 5 мин для инактивации протеиназа K.</li>
	<li>Храните экстракты gDNA при 4 градусах Цельсия или на льду, и немедленно переходите к ПЦР. ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен оставить здесь, поместив экстракты gDNA в морозильную камеру -20 градусов.</li>
	<li>Настройка реакции ПЦР с использованием извлеченных gDNA в качестве шаблона для усиления геномного локуса интереса.<ol>
<li>Если различные аллели в локус интереса отличаются по размеру, так что разница в размерах может быть обнаружена электрофорус геля агарозы, дизайн одного набора грунтовки, чтобы усилить весь локус.</li>
		<li>Кроме того, используйте аллеле-специфические грунтовки, которые генерируют продукты ПЦР только при наличии конкретного аллеля; например, путем проектирования грунтовки, которая связывается с областью, содержащей мутации вставки/удаления.</li>
		<li>Используйте типичную реакционную смесь 20 мл ПЦР следующим образом: 5 мл экстрактов гДНК, 8 мл безнужной воды, 4 мл буфера ПЦР, 0,2 мл 10мМ dNTPs, 0,6 мл DMSO, 1 мл 10 мЛ вперед праймер, 1 мл 10 мл реверсивного грунта , и 0,2 мл полимеразы ДНК (см. Таблица материалов). ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько грунтовок могут быть использованы в реакции ПЦР. Например, один универсальный передний грунт и два аллеля конкретных обратных праймеров могут быть объединены, до тех пор, как два обратных праймера предназначены для создания пЦР продукты различных размеров, так что наличие / отсутствие двух аллелей может быть однозначно определяется гелевым электрофорезом (см. раздел репрезентативных результатов).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Запуск электрофороз геля агарозы, чтобы определить размер и наличие / отсутствие продуктов ПЦР. Отрегулируйте состояние электрофорезаи геля агарозы (например, процент агарозного геля, V/cm, и продолжительность) в зависимости от ожидаемого размера продуктов ПЦР.</li>
	<li>Используйте результаты ПЦР относительно размера и наличия/отсутствия продуктов ПЦР, чтобы назначить генотип каждому послеоперационному эмбриону. Например, если ожидается, что различные аллели будут генерировать продукты ПЦР разных размеров, используйте информацию о размере для присвоения генотипа для каждого эмбриона. Если используются специальные аллелеры, данные о наличии/отсутствии продуктов ПЦР следует использовать для присвоения генотипа каждому эмбриону.</li>
	<li>Сортировать эмбрионы в соответствии с генотипом.</li>
</ol>

<ol><li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li>
<li>Erwin, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cambrian+Conundrum%3A+Early+Divergence+and+Later+Ecological+Success+in+the+Early+History+of+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals.</a> Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).</li>
<li>Putnam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemone+genome+reveals+ancestral+eumetazoan+gene+repertoire+and+genomic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization.</a> Science. 317 (5834), 86-94 (2007).</li>
<li>Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis+occurs+via+invagination+not+ingression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression.</a> Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).</li>
<li>Nakanishi, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockouts+reveal+an+endogenous+role+for+ancient+neuropeptides+in+regulating+developmental+timing+in+a+sea+anemone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone.</a> eLife. 7, e39742(2018).</li>
<li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377(2018).</li>
<li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN+and+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nature Communications. 5, 5486(2014).</li>
<li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development%2C+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li>
<li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694(2016).</li>
<li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li>
<li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian%2C+Nematostella+vectensis%2C+is+mediated+by+Dishevelled%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li>
<li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li>
<li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li>
<li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734(2018).</li>
<li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555(2018).</li>
</ol>

Автору нечего раскрывать.

Описан очерканный здесь протокол на основе ПЦР для генотипа одного морского эмбриона анемона без ущерба для животного. После нереста и де-желе, оплодотворенные яйца могут развиваться в gastrulae. Абраальная область каждого эмбриона гаструлы удаляется хирургическим путем, а изолированная аборальное ткань используется для последующей экстракции геномной ДНК, в то время как остальные послеоперационные эмбрионы заживают и продолжают развиваться. Экстракты gDNA затем используются для анализа ПЦР для определения генотипа каждо...

Книдарийцы представляют разнообразную группу животных, которые включают медуз, кораллов и морских анемонов. Это дипобласты, состоящие из эктодерма и эндодерма, которые разделены внеклеточной матрицей (мезоглией). Cnidaria является сестрой группы для speciose Bilateria, к которому традиционные модели животных, таких как Drosophila и Mus принадлежат1. Кроме того, Cnidaria-Bilateria расхождения, как полагают, имели место в докембрийский период2. Таким образом, сравнительные исследования книдарян и двулатерян имеют важное значение для получения понимания биологии их последнего общего предка. Недавно сравнительная геномика показала, что книдарианцы и двулатеры имеют много генов инструментария развития, таких как выемка и bHLH, подразумевая, что их общий предок уже имел эти гены3. Тем не менее, роль этих генов инструментария развития в последнем общем предке Cnidaria и Bilateria сравнительно менее хорошо понимается. Для решения этой проблемы, очень важно изучить, как эти глубоко сохраненные гены функционируют в книдарии.
Одной из новых книдарских генетических моделей является anthozoan Nematostella vectensis. Его геном был секвенирован3, и различные генетические инструменты, в том числе морфолино-опосредованный ген нокдаун, мегануклеазы опосредованного трансгенеза, и CRISPR-Cas9-опосредованные генные стукины и нокауты, теперь доступны для использования в этом животном. Кроме того, развитие Nematostella относительно хорошо понимается. Во время эмбриогенеза, гастрирование происходит путем инвагинации4, и эмбрион превращается в личинку планулы свободного плавания. Планула впоследствии превращается в полип с ессиальным полипом с ртом и околоустными щупальцами. Затем полип растет и достигает половой зрелости.
CRISPR-Cas9-опосредованный целевой мутагенез в настоящее время регулярно используется для изучения функции генов в Nematostella vectensis5,6,7,8,9. Для генерации нокаут мутантов в Nematostella, коктейль, содержащий локус конкретных одного руководства РНК и эндонуклеазы Cas9 белка впервые вводится в неоплодотворенных или оплодотворенных яиц для производства F0 основателя животных, которые обычно показывают, мозаикизма. F0 животных впоследствии подняли до половой зрелости и пересеклись друг с другом, чтобы произвести F1 населения, подмножество которых может быть нокаут мутантов6. Кроме того, сексуально зрелые животные F0 могут быть скрещены с дикими животными типа для создания F1 гетерозиготных животных, и F1 гетерозиготы, которые несут нокаут аллель в локус интереса могут быть пересечены друг с другом для производства F2 потомство, одна четверть из которых, как ожидается, будет нокаут мутантов5. Оба подхода требуют метода выявления нокаут-мутантов из генетически неоднородной популяции. Полипщу можно использовать для извлечения геномной ДНКдля генотипирования 6,7. Однако в тех случаях, когда исследуется функция развития гена интереса и эмбрионы-мутанты не достигают стадии полипа (т.е. из-за личинок летальности, связанной с мутацией), мутации мутантов необходимо выявить на ранних стадиях онтогена. Описано здесь ПЦР-протокол генотипа отдельных животных на стадии гаструлы без ущерба для животного, который позволяет идентифицировать нокаутмутантов из генетически неоднородной популяции эмбрионов. Продолжительность всего процесса генотипирования зависит от количества эмбрионов, которые должны быть обследованы, но это минимально требует 4-5 ч.

<table><tbody><tr><td>Инкубатор с охлаждением Drosophila Peltier</td><td>Shellab</td><td>SRI6PF</td><td>Используется для индукции нереста</td></tr><tr><td>Растворимая морская соль</td><td>быстрого приготовления Instant ocean</td><td>138510</td><td></td></tr><tr><td>Цисты соленых креветок</td><td>Aquatic Eco-Systems, Inc.</td><td>BS90</td><td></td></tr><tr><td>L-цистеина гидрохлорид</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Стандартный орбитальный шейкер, модель 3500</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCl, 1M, pH8.0</td><td>КАЧЕСТВО БИОЛОГИЧЕСКИЙ</td><td>351-007-01</td><td></td></tr><tr><td>Хлорид калия</td><td>VWR</td><td>BDH9258</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5M pH8</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40 Substitute</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K раствор (20 мг/мл), РНК класса</td><td>ThermoFisher</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>Микро рассекающий иглодержатель</td><td>Roboz</td><td>RS-6060</td><td></td></tr><tr><td>Вольфрамовая игла для рассечения</td><td>Roboz</td><td>RS-6063</td><td></td></tr><tr><td>ПЦР Eppendorf Mastercycler Термоамплификаторы</td><td>Eppendorf</td><td>E6336000024</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Высокоточная ДНК-полимераза</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>GLWамид универсальный прямой праймер</td><td></td><td></td><td>5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3'</td></tr><tr><td>Обратный праймер, специфичный для glw-a</td><td></td><td></td>5<td>'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3'</td></tr><tr><td>Обратный праймер, специфичный для glw-c </td><td></td><td></td><td>5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3'</td></tr></tbody></table>

Генотипирование морского анемона во время раннего развития

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Описано здесь pcR основе протокола генотипа гастрола этап эмбриона anthozoan cnidarian Nematostella vectensis без ущерба для жизни животного. После экстракорпорального оплодотворения и де-желе, зиготы могут развиваться в течение 24 ч при комнатной температуре, чтобы достичь ранней до середины гастральной стадии. Эмбрионы гаструлы затем помещаются на гелевой ложе агарозы в чашке Петри, содержащей морскую воду. Под рассекающим микроскопом вольфрамовая игла используется для хирургического отделения фрагмента асоральной ткани от каждого эмбриона. Послеоперационные эмбрионы затем разрешается залечить и продолжить развитие. Геномная ДНК извлекается из изолированного фрагмента ткани и используется в качестве шаблона для локуса конкретных ПЦР. Генотип может быть определен на основе размера продуктов ПЦР или наличия/отсутствия специфических пЦР-продуктов. Послеоперационные эмбрионы затем сортируются по генотипу. Продолжительность всего процесса генотипирования зависит от количества эмбрионов, которые должны быть обследованы, но это минимально требует 4-5 ч. Этот метод может быть использован для выявления нокаут мутантов из генетически неоднородной популяции эмбрионов и позволяет анализировать фенотипы во время развития.

Геном Nematostella имеет один локус, который кодирует белок-предшественник для нейропептида GLWamide. Три нокаутмутант аллеля на этом локусе(glw-a, glw-b,и glw-c) ранее сообщалось5. Четыре гетерозиготных самца, несущие аллель дикого типа (яп. ) и нокаут аллель glw-cна локусе GLWamide (генотип: Q/glw-c)были скрещены с гетерозиготной самкой, несущей аллель дикого типа ...

Целью этого протокола является генотип морского анемоне Nematostella vectensis во время гастрирования без ущерба для эмбриона.

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Этот протокол позволяет исследователю определить мутантные морские анемоны во время раннего эмбриогенеза, так что постэмбриональный фенотип развития может быть проанализирован. Основным преимуществом этого метода является то, что он может быть использован для генотипа отдельных морских анемонов в начале онтогении без ущерба для жизни животного. Демонстрацией этой процедуры будет Мигель Сильва, аспирант моей лаборатории.За день до индукции нереста поместите анемон нематостелла vectensis в температуру и свет контролируемых инкубатор, программирование инкубатора так, что животные подвергаются воздействию восьми часов света при температуре 25 градусов по Цельсию. На следующий день, удалить животных из инкубатора и оставить их на скамейке верхней при комнатной температуре со светом, чтобы нерест, который будет происходить в течение следующих полутора-двух часов. Используйте перенесите пипетку, наконечник которой разрезается, чтобы увеличить отверстие, чтобы поместить пакеты яйцеклеток из женского контейнера в сперматозоиды, содержащие мужской контейнер, и оставить их в мужском контейнере, по крайней мере 15 минут, чтобы обеспечить оплодотворение.После оплодотворения, чтобы dejelly яичные пакеты, поместите их в морскую воду, содержащую 3%cysteine на стеклянной чашке Петри и осторожно агитировать на шейкер в течение 12 минут. Затем разбить комки с пластиковой пипеткой и продолжать агитировать еще две-три минуты, пока полностью dejellied. Держите оплодотворенные яйца на том же блюде при температуре 16 градусов по Цельсию или при комнатной температуре.На следующий день подготовь буфер извлечения ДНК, описанный в рукописи, хорошо перемешивайте вихрем и вбив его в ПЦР-трубки, добавляя по 20 микролитров к каждой трубке. Растворите 1%agarose в морской воде, залить его в чашку Петри, чтобы покрыть дно, и охладить на скамейке сверху, чтобы сделать гель кровать. Обложка гель кровать со свежей морской водой.Передача 24-часовых эмбрионов после оплодотворения с помощью пипетки в агарозный гель, содержащий чашку Петри. Вставьте вольфрамовую иглу в держатель необходимости и стерилизовать, окунув его кончик в алкоголь и поместив его в пламя, чтобы сжечь алкоголь. Под рассечением микроскопа, сделать депрессию на агарозе с помощью вольфрама иглы, чтобы удалить кусок поверхности агарозы размером с эмбрион, чтобы манипулировать.Затем, используя вольфрамовую иглу, поместите эмбрион в депрессию с боковой стороной лицом вниз, чтобы ограничить движение эмбриона для микрохирургии. Для того, чтобы выполнить успешную операцию, крайне важно ограничить движение эмбриона. С помощью вольфрамовой иглы хирургическим путем удалите кусок аборигенной ткани вдоль оси перорального аборала, расположенной напротив перорального бластопорального отверстия.С помощью P20 пипетки перенесите изолированную аборигенную ткань в ПЦР-трубку, содержащую 20 микролитров буфера извлечения ДНК. Перенесите послеоперационный эмбрион в колодец из 24-хорошо пластины, содержащей не менее 500 микролитров пресной морской воды. И поместите пластину, содержащую послеоперационные эмбрионы, в инкубатор при 16 градусах цельсия до завершения генотипирования.Чтобы извлечь геномную ДНК из одиночных эмбрионов, сначала кратко вращайте ПЦР-трубки, содержащие буфер извлечения ДНК и изолированные эмбриональные ткани с помощью мини-центрифуги. Затем инкубировать трубки при 55 градусах по Цельсию в течение трех часов в то время как вихри в течение 30 секунд каждые 30 минут, чтобы обеспечить распад клеток сгустки и повышения лиза клеток. После инактивации протеиназы K при 95 градусах по Цельсию в течение четырех минут, создали реакцию ПЦР, используя извлеченную геномную ДНК в качестве шаблона для усиления локуса интереса.Дизайн желаемых грунтовок, как описано в рукописи. Настройка 20 микролитров ПЦР реакции. После завершения ПЦР, запустить агарозный гель электрофорез, чтобы определить размер и наличие или отсутствие продуктов ПЦР, убедившись, что настроить состояние агароза гель электрофорез в зависимости от ожидаемого размера продуктов ПЦР.Используйте результаты ПЦР в отношении размера и присутствия или отсутствия или ПЦР продуктов для присвоения генотипа каждому послеоперационному эмбриону, а затем сортировать эмбрионы в соответствии с их генотипом. Геном нематостеллы имеет один локус, который кодирует белок-предшественник нейропептида, GLWamide. Ранее сообщалось о трех нокаут-мутантных аллелях на локусе.ПЦР результаты случайно отобранных эмбрионов среди потомства F1 крест между одной гетерозиготной женщины проведения нокаут аллель и гетерозиготных мужчин проведения C нокаут аллель показать различные генотипы. Эмбрионы один и два показывают одну ПЦР-группу, соответствующую ожидаемого размера аллеля нокаута. Эмбрионы три и шесть показывают две группы ПЦР с ожидаемыми размерами для нокаута аллели А и C.Embryos четыре, семь, и восемь показывают одну группу ПЦР, соответствующие ожидаемого размера C нокаут аллель.Embryo 5 не показывает полос, что свидетельствует об отсутствии связывания грунтовки. Чтобы исключить возможность геномного отказа извлечения ДНК, другой ПЦР был запущен с использованием обратного грунтовки, которая может связываться с дикой последовательности типа. В тех случаях, когда был обнаружен продукт ПЦР ожидаемого размера, геномная экстракция ДНК была успешной.В то время как ни один продукт не предложил сбой в извлечении. Хотя этот протокол предназначен для эмбрионов морского анемона, он, несомненно, можно применить этот метод к другим книдарянам, таким как кораллы и медузы, где геномная информация и эмбрионы доступны. После этой процедуры, выявленные мутанты используются для оценки фенотипа развития.Например, гистологические методы, такие как иммуностимунизация могут быть использованы для оценки дефектов в морфологии, в то время как на месте гибридизации, в режиме реального времени количественные RT-PCR, и РНК-сек могут быть использованы для оценки дефектов в экспрессии генов. Кроме того, живая визуализация может быть использована для оценки дефектов в поведении во время пост-эмбрионального развития, например, у личинок или в ранних полипах.

genotyping-of-sea-anemone-during-early-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Биология развития

Микроинъекция является общим методом, используемым для доставки конструкций ДНК, мРНК, морфолино антисмысловых олигонуклеотидов или другие процедуры в яиц, эмбрионов и клеток различных видов.

Высокая пропускная Микроинъекции из морского ежа зиготы

Амфипода Parhyale hawaiensis является перспективным модельным организмом для изучения ракообразных эмбриологии и сравнительной развития членистоногих и эволюции. Этот протокол описывает способ ручного удаления отдельных бластомеров из ранних эмбрионов на стадии дробления из Parhyale.

Устранение одну клетку от Восемь клеток эмбрионов из амфипод ракообразных<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Методы, которые производят morphant эмбрионов необходимы для изучения механизмов развития и генных регуляторных сетей. Морская звезда Patiria miniata является новым модельной системой для этих исследований. Здесь мы приводим протокол для получения гаметы, производство культур эмбрионов, и быстрое микроинъекции зигот от этого вида.

Метод микроинъекции Patiria Minata Зиготы

Цель этого протокола — предоставить пользователям набор методов для высокопроизводительной декапсуляции эмбрионов и личинок Lymnaea stagnalis при подготовке к гибридизации in situ в целом, а также для последующих пре- и постгибридизационных обработок.

Целый Маунт<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация метод для брюхоногих моллюска<em&gt; Большой Прудовик</em

Здесь мы демонстрируем, как индуцировать и контролировать регенерацию у звездчатого морского анемона Nematostella vectensis, модельного книдарийского антозоя.  Мы демонстрируем, как ампутировать и категоризировать регенерацию с помощью системы морфологического стадирования, и мы используем эту систему для выявления потребности в аутофагии в регенерирующих полипных структурах.

Наводить Complete полипа Регенерация от спинных Physa из Starlet актинии Nematostella vectensis

Это видео статье подробно простой в методологии естественных условиях , которые могут быть использованы для систематического и эффективного характеризуют компоненты сложных сигнальных путей и регуляторных сетей во многих беспозвоночных эмбрионов.

Сила простоты: Эмбрионы морского ежа, как<em&gt; В Vivo</em&gt; Развивающие модели для изучения сложных Cell-к-Cell Signaling сетевых взаимодействий

Цель настоящего Протокола заключается в выполнить в situ гибридизация на взрослых коралловые образцы, которые заливали в парафин и секционного на стеклянных вставках. Это качественный метод, используемый для визуализации пространственное выражение смысл борьбы с зонд РНК в парафин врезанных тканей.

На месте Методы гибридизации парафин врезанных взрослых коралловые образцов

Этот протокол позволяет визуализации экспрессии генов в эмбриональных Астианакт cavefish. Этот подход был разработан с целью максимального сигнала выражения гена, минимизируя фон неспецифичный пятнать.

Wholemount в гибридизации Situ Астианакт эмбрионов

Эта работа описывает полу-высокой пропускной протокол, который позволяет одновременное 3D замедленной визуализации эмбриогенеза в 80-100 C. elegans эмбрионов в одном ночном запуске. Кроме того, для оптимизации анализа данных включены инструменты обработки изображений и визуализации. Сочетание этих методов с пользовательскими штаммами репортера позволяет детально контролировать эмбриогенез.

Полу-высокой пропускной способ визуализации и инструментвизуализации данных для анализа C. elegans эмбрионального развития

Здесь мы описываем протокол получения экстракта сырого яда из морского анемона и выявления его гемолитической и фосфолипазной активности.

Идентификация гемолитической и фосфолипазной активности в сырых экстрактах из морских анемонов с помощью простых биоанализов

Представлен иммунопреципитативный анализ хроматина (X-ChIP) против гистоновой метки H3K4me3 для модельного организма Exaiptasia diaphana . Специфичность и эффективность анализа подтверждены количественной ПЦР и секвенированием нового поколения. Этот протокол позволяет расширить исследования белок-ДНК-взаимодействий в актрении E. diaphana.

Иммунопреципитация хроматина в модельной системе Книдария Exaiptasia diaphana

Узнайте метод генотипирования морского анемона Nematostella vectensis на стадии гаструляции без гибели эмбриона. Этот подход позволяет идентифицировать мутантов рано в онтогенезе для анализа постэмбриональных фенотипов.

Генотипирование морского анемона во время раннего развития

Больше видео