Оценка клеточный иммунный ответ плодовой мушки Drosophila melanogaster, используя Assay фагоцитоза в естественных условиях
10 апреля 2019 г.
Этот протокол описывает в естественных условиях фагоцитоза assay в взрослых Drosophila melanogaster для количественного определения фагоцитарной признание и распродажа микробной инфекции.
Это в Виво фагоцитоз анализ позволяет исследователям проводить генетические экраны и генома всей ассоциации исследований для выявления новых генов, которые регулируют фагоцитоз во взрослых кровяных телец. Этот эксперимент является количественным, простым в проведении и может быть применен к скринингу живых животных на факторы-хозяина, влияющие на распознавание патогенов, поглощение и очистку. После потянув тонкостенные стеклянные капилляры с иглой шкив, использовать микрометр, чтобы держать иглу под микроскопом, и использовать номер пять, тонкой точки, пинцет из нержавеющей стали, чтобы сломать кончик на 100-микрометровый диаметр кончика.
Чтобы измерить объем жидкости, которая будет введена в каждую муху, загрузите капиллярную иглу стерильной 5%пищевой краситель в PBS, и изгнать жидкость на каплю минерального масла на 0,01-миллиметровый микрометр стадии. Выделите 10 микролитров по 1,6 миллиграмма на миллилитровые частицы на небольшой квадрат Парафильма и потяните жидкость в иглу. Намонтировать иглу в сопло инжектора, и линия анестезированной мух вдоль их назначенной области на лету площадку, брюшной стороне вверх, с головами, ориентированными на передней части площадки.
Поместите флаконы в соответствующих областях на скамейке, и вводить мух в верхнем углу живота с пятью, 100-миллисекундные насосы жидкости, чтобы доставить около 10 нанолитров частиц в общей сложности. Перенесите каждую муху в соответствующий флакон по мере введения, увежев время на флаконе. Затем загрузите новую иглу раствором 0.4%Trypan Blue и установите пневматический инжектор на закрытый, чтобы постоянный поток воздуха выталкивал жидкость из иглы.
Через 30 минут после первоначальной инъекции, вводить каждую муху живота с Trypan Blue до тех пор, пока животы полны и разтянуты. Гора мух на микроскоп слайды с электрической лентой, брюшной стороны вниз, толкая крылья в сторону мухи, чтобы обеспечить их на ленту. Затем осторожно нажмите головой в ленту, чтобы убедиться, что муха не будет двигаться.
Сразу же после того, как все мухи были обеспечены, изображение насекомых, по одному, в 25 или 32 раза увеличение на перевернутый флуоресценции микроскоп прилагается к цифровой камере и компьютеру, сосредоточив внимание на спинной сосуд каждой мухи с помощью компьютерного программного обеспечения для цифровой камеры. Затем завехать время экспозиции и увеличение между экспериментами. Для количественной оценки флуоресценции откройте соответствующую программу анализа изображений и откройте одно изображение.
Для измерения интенсивности флуоресценции спинного сосуда нарисуйте полигон вокруг спинного сосуда и выберите меру для записи интенсивности флуоресценции внутри полигона. Чтобы определить интенсивность фоновых флуоресценций, скопировать первый полигон, и переместить его в область, прилегающую к спинной сосуд каждой мухи. Затем выберите Меру и замитьте интенсивность флуоресценции фоновой области.
Для нормализации флуоресценции спинного сосуда фоновой флуоресценцией, после измерения интенсивности флуоресценции остальных мух, разделите флуоресценцию спинного сосуда на фоновую флуоресценцию и вычислите среднюю нормализованную интенсивность флуоресценции спинного сосуда всех мух в одном штамме. После установки брюшной стороны вниз на кусок электрической ленты, первые два сегмента живота, где спинной сосуд находится, хорошо видны. Основные источники экспериментальной ошибки возникают на этапах инъекций и визуализации процедуры.
Использование одной и той же иглы для введения нескольких мух может привести к тому, что она засоряется тканью мухи или частицами. Мухи, которые не получают достаточно флуоресценции Трипан Голубой ярко по всей их брюшной полости, что может уменьшить отношение спинного сосуда к фоновой флуоресценции, тем самым уменьшая истинное соотношение интенсивности флуоресценции животного. Мухи следует фотографировать, обездвижив углекислым газом, так как активно движущиеся мухи производят размытые изображения, которые не поддаются количественной оценке.
Мутант линии из коллекции Зукер этил метансульфонат обработанных мух не в состоянии фагоцитозных грамотрицательных и грамположительных бактерий и отображает почти нет спинного сосуда флуоресценции в анализе фагоцитоза in vivo, в паре с изогенным фоном штамма Цукер и другой общий штамм лабораторного контроля. Следите за временем и порядком, в котором мухи вводятся для обеспечения того, чтобы мухи находятся на сопоставимых стадиях распознавания патогенов и поглощения при изображении. Молекулярные механизмы, лежащие в основе фагоцитных дефектов, могут быть определены путем изучения одиночных гемоцитов с конфокальные микроскопии или после флуоресценции активированной сортировки клеток или магнитной изоляции бисера взрослых гемоцитов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод анализа фагоцитоза in vivo у взрослых особей Drosophila melanogaster для количественной оценки распознавания и элиминации микробных инфекций фагоцитами. Этот эксперимент является количественным, простым в исполнении и может применяться для скрининга живых животных с целью поиска факторов хозяина, влияющих на распознавание, захват и элиминацию патогенов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Генетика
Теоретические сведения
- Фагоцитоз является критически важным иммунным ответом.
- Drosophila melanogaster служит модельным организмом.
- Понимание функций фагоцитов может дать представление о механизмах иммунной регуляции.
- Данный анализ облегчает проведение генетического скрининга для идентификации соответствующих генов.
Цель исследования
- Количественная оценка активности фагоцитов в ответ на микробные инфекции.
- Идентификация новых генов, регулирующих фагоцитоз.
- Углубление понимания взаимодействий между хозяином и патогеном.
Используемые методы
- Подготовка тонкостенных стеклянных капилляров для инъекций.
- Использование стерильного пищевого красителя в PBS для измерения объема жидкости.
- Дозирование частиц на Parafilm для последующего введения мухам.
- Позиционирование анестезированных мух для точного проведения инъекции.
Основные результаты
- Успешное количественное определение распознавания и клиренса фагоцитами.
- Идентификация генетических факторов, влияющих на фагоцитоз.
- Демонстрация применимости метода анализа на живых животных.
- Содействие дальнейшим исследованиям иммунных ответов.
Выводы
- Анализ фагоцитоза in vivo является ценным инструментом для исследователей.
- Он позволяет изучить генетическое влияние на функцию иммунитета.
- Будущие исследования могут опираться на эти данные для совершенствования иммунологических изысканий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный анализ фагоцитоза in vivo на Drosophila melanogaster представляет собой генетически доступную систему для оценки взаимодействий между хозяином и патогеном, а также для идентификации генетических регуляторов клеточного иммунитета. Его количественный и воспроизводимый результат позволяет проводить валидацию мишеней на ранних стадиях и снижать механистические риски в программах по поиску препаратов для иммунологии. Данный анализ поддерживает кампании по скринингу для приоритизации терапевтических мишеней с прогностической достоверностью в отношении функции врожденного иммунитета.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения поглощения и уничтожения частиц в живых организмах.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков с помощью генетического скрининга для идентификации новых генов, влияющих на фагоцитоз.
- Прогностическая ценность: помогает в приоритизации портфеля исследований путем установления связи между активностью гемоцитов и механизмами распознавания и элиминации патогенов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает количественные измерения флуоресценции, которые позволяют проводить стандартизированную оценку эффективности фагоцитоза при различных генетических особенностях.
- Практическая ценность: предлагает масштабируемый и простой в исполнении рабочий процесс, совместимый со скринингом факторов хозяина на живых животных.
- Воспроизводимость: гарантирует стабильные результаты за счет контролируемого дозирования частиц и нормализации интенсивности флуоресценции дорсального сосуда.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Предоставляет релевантную для заболевания систему для изучения консервативных механизмов врожденного иммунитета с привязкой к трансляционным биомаркерам.
- Операционная ценность: Позволяет принимать решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков путем корреляции дефектов фагоцитоза с фенотипами мутантов.
- Прогностическая ценность: Способствует снижению механистических рисков за счет выявления генетических факторов, модулирующих захват и элиминацию патогенов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ предназначен для использования на ранних этапах поиска новых лекарственных средств с целью проверки гипотез и уточнения сигнальных путей в иммунологии, а также имеет прямое применение при идентификации перспективных соединений-лидеров посредством генетического скрининга факторов хозяина, влияющих на элиминацию микроорганизмов.
- Биология открытий: Позволяет проверять гипотезы о механизмах фагоцитоза путем измерения поглощения частиц гемоцитами Drosophila в контролируемых условиях.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа и получение количественных данных для оценки генетических вариантов, влияющих на распознавание и поглощение патогенов.
- Аналитика: Позволяет получать нормализованные показатели интенсивности флуоресценции для сравнения фагоцитарной активности в различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями за счет использования эволюционно консервативных иммунных путей беспозвоночных и млекопитающих.
- Корпоративное повторное использование: Служит многократно используемой платформой для скрининга иммунологических мишеней благодаря генетической доступности и количественному дизайну.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени за счет снижения механистической неоднозначности клеточных иммунных ответов.
- Операционная ценность: гарантирует стандартизацию и воспроизводимость благодаря точному введению частиц и количественному определению флуоресценции.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки за счет раннего выявления фагоцитарных дефектов у мутантных штаммов.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию мишеней с поправкой на риск на основе их влияния на эффективность элиминации патогена.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с Drosophila, навыками микроинъекций и флуоресцентной микроскопии.
- Результат зависит от использования пневматических инжекторов, капиллярных игл и систем визуализации для стабильной доставки и детекции частиц.
- Необходимы стандартизированные протоколы иммобилизации мух и их крепления на брюшную сторону для обеспечения воспроизводимости визуализации.
- При расширении области применения анализа на другие типы частиц или модели инфекции требуются соответствующие адаптации.
- Практические ограничения включают засорение иглы тканями мухи и вариативность инъекций Trypan Blue, влияющую на фоновую флуоресценцию.
