Полностью человека опухоли на основе матрицы в трехмерном Сфероидных вторжения анализ
7 мая 2019 г.
Микросреда опухоли является неотъемлемой частью роста и вторжения рака. Для имитации прогрессирования карциномы необходима биологически соответствующая человеческая матрица. Этот протокол вводит улучшение для экстракорпорального трёхмерного вторжения сфероидных проб путем применения человеческой лейомиомы на основе матрицы. Протокол также вводит компьютерный анализ вторжения ячейки.
Как мы уже знаем, микроокнония опухоли является неотъемлемой частью роста и вторжения рака. Чтобы имитировать прогрессирование карциномы, нам нужна биологически соответствующая матрица опухоли человека. Это единственная матрица опухоли человека, основанная на анализе вторжения в пробирку.
По сравнению с классическим сфероидным анализом, этот метод не так чувствителен к температуре и не требует передачи сфероидов. Этот метод подходит для пациентов, полученных твердых образцов рака, таких как голова и шея карциномы и может распространяется на персонализированную медицину, включая химиорадиации терапии. Эта человеческая матрица на основе опухоли уже используется для нескольких применений, включая высокой пропускной способности тестирования на наркотики, анализ живых клеток, заживление ран, и передачи анализов.
Наиболее технически чувствительным шагом является обработка метода фибриногена добавляется так что вы можете сначала практиковать этот шаг с пустыми скважинами. Важно, чтобы показать правильную обработку матрицы, и это легко анализировать, показывая метод визуально. Для многоклеточной генерации сфероидов опухоли, обойтись один раз 10 до третьих клеток из клеточной линии интереса в 50 микролитров полной среды в каждый колодец 96-ну ультра-низкой крепления круглой нижней пластины.
Затем поместите пластину в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислый газ клеточной культуры инкубатор в течение четырех дней, прежде чем визуально подтвердить образование опухоли сфероидов с перевернутым микроскопом. Чтобы создать трехмерный анализ вторжения сфероидов, оттепель человека миомы полученных матрицы на льду и оттепели фибриногена фондового раствора в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Когда реагенты нагреваются, смешать соответствующие объемы полной среды, человека миомы полученных матрицы, тромбина, апротинина и фибриногена, добавив фибриноген незадолго до дозирования матричной смеси в клетки.
Немедленно добавьте 50 микролитров полученного геля в каждый колодец пластины сфероидной культуры, направляя кончик к внутренней стене каждой хорошо и трубя замедление, не перемещая сфероид из центра хорошо. Так как фибриноген начинает гель через несколько минут, он требует надежной, но точной обратной трубы и обработки только несколько скважин за один раз. Вернуть пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 30 минут, чтобы позволить человеку миомы полученных матричных фибринов гель затвердеть, прежде чем аккуратно добавить 100 микролитров полной среды в верхней части каждого геля.
Затем ежедневно изображение фероидного вторжения. Для сегментации изображений с помощью ilastik откройте программное обеспечение для классификации и сегментации изображений с открытым исходным кодом и выберите рабочий процесс классификации пикселей. Сохраните проект ilastik на компьютере.
Пиксели будут классифицированы на основе аннотаций, сделанных пользователем. Нажмите Входные данные и добавить новые, чтобы выбрать изображения для анализа. Для выбора функций нажмите Наберите функции и выберите функции.
Нажмите соответствующие коробки, чтобы выбрать особенности, представляющие интерес. Выбранные коробки позеленуют. Для обучения нажмите Обучение.
В разделе Обучение должно быть две метки: Label 1 и Label 2. Отметь фон одной из меток и отметь ячейки другой этикеткой. Когда все ячейки и фон в первом изображении были помечены, выберите следующее изображение из текущего представления, чтобы продолжать отмечать ячейки и фон до тех пор, пока 10% изображений не будут помечены.
Затем выберите Live Update для анализа всех изображений. Когда обучение было завершено и ilastik проанализировал все изображения, нажмите Прогноз экспорта и выберите простой сегментации из источника. Затем выберите желаемый формат файла вывода из настроек изображения Select Export Image и нажмите Export All, чтобы экспортировать результаты маркировки.
Файлы будут экспортироваться в ту же папку с исходными изображениями. Для анализа области, сначала откройте исходное изображение с баром масштаба в Fiji ImageJ, заботясь о том, чтобы изображение имеет тот же размер и размер, что и проанализированные изображения. Используйте инструмент выбора строки, чтобы нарисовать линию известной длины и нажмите Анализ и Установить шкалу.
Затем установите известное расстояние в известном дистанционном поле. Установите соответствующий блок и нажмите Global. Чтобы установить плагин ilastik, нажмите Справка и обновление и нажмите Управление обновления сайтов в окне обновления ImageJ.
Нажмите рядом с ilastik, Закройте и примените изменения. Через несколько минут появится информационное окно, которое будет успешно обновляться. Нажмите OK и перезапустите ImageJ.
Далее нажмите Плагины, Макрос, и установить и выбрать счетчик. ijm файл. Затем нажмите Open.
Чтобы завершить анализ области, нажмите Plugins и прокрутите, чтобы выбрать ilastik. Выберите Import HDF5 и выберите файл в формате h5. Нажмите Открыть и загрузить и применить таблицу осмотра.
Затем нажмите кнопку A на клавиатуре, и область появится в сводном окне в качестве общей площади. В этом репрезентативном эксперименте, через четыре дня после метастатического ларингального плоскоклеточного карциномы линии посева, матрица была добавлена на сформированные сфероиды, как попродемонстрировано, и вторжение отслеживалось ежедневно на перевернутом микроскопе. После встраив, клетки в человека миомы полученных фибрина матрицы начали быстро вторгаться после одного дня и распространяется в матрицу в течение ближайших двух дней.
Клетки в матрице саркомы мыши не вторгались в окружающую матрицу, вместо этого образуя асимметричную структуру. Клетки коллагена вторглись немного, но из-за усадки матрицы анализ стал трудным. В некоторых скважинах сфероиды даже исчезли через три дня.
Здесь показана количественная оценка вторжения первичной и метастатической ларингальной плоскоклеточной карциномной клетки в матрице фибрина, полученной из миомы человека. Анализ живых клеток человека миомы полученных фибринов матрицы сфероида вторжения показывает движение клеток в прядях по всей матрице, которая следует другие клетки с течением времени. Помните, чтобы быть осторожным, чтобы не переместить сфероид из положения центра при добавлении матрицы к скважинам.
Эта процедура может быть использована для изучения того, как облучение и конкретные молекулы, такие как раковые препараты влияют на вторжение. Клетки могут быть исправлены и окрашены для последующих исследований. В классической модели саркомы мыши клетки в основном размножаются, а аспект вторжения минимален.
Эта человеческая матрица на основе опухоли вызывает вторжение, делая исследования ингибирования более эффективными.
Обзор
В данном исследовании представлен новый метод трехмерного анализа инвазии сфероидов in vitro с использованием матрикса, полученного из лейомиомы человека, что позволяет более точно имитировать прогрессирование карциномы. Данный метод обеспечивает улучшенный анализ инвазии опухолевых клеток и применим к образцам солидных опухолей, полученным от пациентов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология рака
- Опухолевое микроокружение
- Анализы in vitro
Общие сведения
- Микроокружение опухоли играет критическую роль в росте и инвазии раковых клеток.
- Биологически релевантный матрикс опухоли человека необходим для точного моделирования прогрессирования карциномы.
- Данный метод менее чувствителен к температуре по сравнению с классическими анализами сфероидов.
- Он подходит для применения в области персонализированной медицины, включая химиолучевую терапию.
Цель исследования
- Разработать метод анализа на основе матрикса опухоли человека для изучения инвазии раковых клеток.
- Представить протокол, минимизирующий технические сложности, связанные с традиционными методами.
- Обеспечить возможность высокопроизводительного тестирования препаратов и анализа живых клеток.
Используемые методы
- Создание многоклеточных опухолевых сфероидов в планшетах с ультранизкой адгезией.
- Подготовка фибриногена и матрикса, полученного из миомы человека, для анализа инвазии.
- Ежедневная визуализация инвазии сфероидов с помощью инвертированного микроскопа.
- Анализ изображений с использованием программы ilastik для сегментации и количественного определения площади.
Основные результаты
- Клетки в матриксе, полученном из миомы человека, инвазировали быстро, что продемонстрировало эффективное моделирование поведения опухоли.
- Сравнение с другими матриксами выявило отчетливые паттерны инвазии, подчеркивая преимущества матрикса человеческого происхождения.
- Анализ живых клеток показал динамику перемещения и инвазии клеток с течением времени.
- Данный метод может быть адаптирован для изучения влияния различных видов терапии на инвазию опухоли.
Выводы
- Матрикс, полученный из миомы человека, представляет собой надежную платформу для изучения инвазии раковых клеток.
- Данный анализ может способствовать проведению исследований терапевтических методов лечения рака.
- Правильное обращение с материалами и соблюдение методологии имеют решающее значение для успешного проведения анализа.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный анализ восполняет критический пробел в доклинических исследованиях рака, предоставляя матрикс, полученный из опухолей человека, который лучше воспроизводит микроокружение in vivo по сравнению с альтернативами животного происхождения. Он позволяет осуществлять более точное прогностическое моделирование инвазии карциномы, поддерживая валидацию мишеней и снижение механистических рисков на ранних этапах поиска. Платформа подходит для скрининговых приложений и обеспечения трансляционной преемственности, особенно для карциномы головы и шеи, а также для образцов, полученных от пациентов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем функциональной валидации мишеней в контексте внеклеточного матрикса, релевантного для человека.
- Операционная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет прямого наблюдения фенотипов инвазии в биологически значимой системе.
- Прогностическая ценность: Облегчает отбор перспективных соединений в портфеле путем идентификации веществ, модулирующих инвазию в модели, которая предсказывает поведение опухоли у человека.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: предоставляет стандартизированную воспроизводимую 3D-систему для количественной оценки влияния соединений на инвазию клеток.
- Практическая ценность: обеспечивает высокопроизводительный скрининг препаратов с минимальной технической вариабельностью за счет снижения температурной чувствительности и отсутствия необходимости переноса сфероидов.
- Масштабируемость: совместимость с 96-луночными планшетами с ультранизкой адгезией позволяет миниатюризировать анализ и проводить скрининг при различных условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: Использование матрикса, производного от лейомиомы человека, позволяет связать результаты первичных исследований с доклинической валидацией в системе, соответствующей патологии заболевания.
- Сопоставимость биомаркеров: Обеспечивает возможность анализа динамики инвазии живых клеток, что позволяет установить корреляцию с молекулярными сигнатурами или ответом на лечение.
- Оптимизация рисков при разработке: Поддерживает принятие решений о целесообразности дальнейших исследований («go/no-go») путем количественной оценки ингибирования инвазии — ключевой фенотипической конечной точки при предотвращении метастазирования.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в общую цепочку разработки препаратов: от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, что особенно актуально для программ, направленных на изучение метастазирования.
- Фундаментальная биология: Позволяет проверять гипотезы о факторах, стимулирующих инвазию, и модификаторах путей в контексте микроокружения опухоли человека.
- Скрининг: Обеспечивает получение количественных данных на основе визуализации, подходящих для автоматизированного анализа и профилирования соединений.
- Аналитика: Позволяет измерять площадь инвазии с помощью ilastik и ImageJ, что обеспечивает возможность статистического сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты с доклинической работой путем моделирования ключевого этапа метастазирования с использованием матрицы человеческого происхождения.
- Прикладное использование: Создает многократно используемую платформу, применимую для различных типов солидных раков и методов терапии, включая химиолучевую терапию.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения зависимости от матриц нечеловеческого происхождения, которые плохо имитируют строму опухоли человека.
- Операционная ценность: Улучшает воспроизводимость и стандартизацию благодаря определенному протоколу подготовки матрикса и рабочему процессу визуализации.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет более точного раннего прогнозирования клинической транслябельности, снижая вероятность неудач на поздних стадиях из-за несовершенного моделирования метастазирования.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию перспективных соединений с учетом рисков на основе способности подавлять инвазию в системе, релевантной для человека.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с 3D-культурами клеток, манипуляций с матриксом и соблюдение правил стерильности при приготовлении фибринового геля.
- Необходим доступ к инвертированным микроскопам, программному обеспечению ilastik и Fiji ImageJ для визуализации и анализа.
- Требуется межкомандная стандартизация процессов формирования сфероидов и дозирования матрикса во избежание позиционных артефактов.
- Адаптация метода для других модельных систем требует валидации совместимости матрикса и кинетики инвазии.
- Практическое ограничение: фибриноген инициирует быстрое гелеобразование, что требует точного и своевременного дозирования пипеткой для сохранения целостности сфероидов.
