Локализация сумо-модифицированных белков с использованием флуоресцентного сумо-улавливания белков
27 апреля 2019 г.
Сумо является важным и очень консервативны, Малый убиквитин-как модификатор белка. В этом протоколе мы описываем использование устойчивых к стрессу рекомбинантного белка-улавливания сумо (kmUTAG) для визуализации родных, незамаркированных спрятаных концентов сумо и их локализации в различных типах клеток.
Значение этого протокола заключается в использовании нового флуоресцентного белка SUMO-ловушки UTAG для обнаружения белкового модификатора SUMO в различных эукариотических клетках. Основным преимуществом этого метода является простой протокол для обнаружения SUMO без антител в различных клетках, включая культуру тканей млекопитающих и нематодные гонады. SUMO играет важную роль в раковых и нейродегенеративных расстройствах, и это подчеркивает необходимость надежных и надежных инструментов для обнаружения и функционального анализа сумо-модифицированных белков.
Поскольку SUMO очень сохраняется, флуоресцентный белок UTAG, улавливАющий SUMO, может быть использован для обозначения конъюгированных СУМО во многих различных организмах. Это видео демонстрирует его использование в клетках млекопитающих. Кроме того, полный текст описывает его использование в нематодных ооцитах.
Визуальная демонстрация этого метода дает критические подсказки для лечения клеток до окрашивания и обнаружения СУМО. Для начала вырастите клетки культуры тканей выбора на 22-миллиметровой круглой крышке скользит в шести-хорошо TC пластин до 70 до 80% стечения. Вымойте клетки кратко с одним миллилитров DPBS.
Чтобы исправить клетки, добавьте два миллилитров свежих 4%PFA и DPBS к каждому хорошо. Инкубировать клетки в течение 20 минут при комнатной температуре. Вымойте фиксированные клетки три раза в течение пяти минут в один миллилитр DPBS при гайке пластины.
Чтобы пронизать клетки, инкубировать в течение 15 минут с 1%Triton X-100 в DPBS. Вымойте клетки снова, как и раньше. Инкубировать клетки с 500 микролитров 1 молярного глицина HCL pH 2 в течение 10 секунд.
Затем немедленно нейтрализуем рН с помощью 500 микролитров буфера 10X SUMO Protease или SPB. После мытья клеток, как и прежде, удалить крышку скользит из дома и поместить их в камеру влажности. Только для окрашивания UTAG-FL смешайте один микрограмм UTAG-FL со 100 микролитров 1X SPB, содержащими пять миллимоляров TCEP в трубке.
Затем, пипетка смесь на клетки на крышке скольжения и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа в камере влажности. Чтобы вымыть крышку скользит, пипетка 200 микролитров DPBS на каждой крышке скольжения и оставить на месте в течение 10 минут. Повторите стирку еще два раза.
Удалите крышку скользит от последней стирки и инвертировать на предварительно очищенные микроскопии слайд с каплей монтажа среды. Храните образцы на ночь в морозильной камере 20 градусов по Цельсию перед просмотром под микроскопом. Визуализуйте ячейки с помощью соответствующих наборов фильтров для DAPI и Texas Red.
Пожалуйста, смотрите полный текст протокола о том, как маркировать SUMO и фиксированные нематодные гонады. Хотя маркировка клеток млекопитающих довольно проста, маркировка нематодных яйцеклеток требует предварительной подготовки в гонадных вскрытиях. KmUTAG-FL, инкубированный фиксированными клетками PMT2, показал отчетливое ядерное окрашивание.
Были видны как диффузные ядерные окрашивания, так и различные ядерные очаги. Ядерная локализация была подтверждена с использованием совместного окрашивания с DAPI. В соответствии с деятельностью СУМО по захвату Кмутаг-FL, модель локализации ядерного оружия напоминала окрашивание SUMO23.
Совместное окрашивание анти-SUMO23 8A2 антителом подтвердило коа локализацию KmUTAG-FL с сигналом SUMO23. Это подтверждает эффективность KmUTAG-FL для обнаружения SUMO23 в клетках млекопитающих. Изолированные гонады от яйцеклеток, производящих взрослый гермафродит c.
нематоды elegans были помечены антителами против СУМО. В соответствии с предыдущими докладами, антитела против СУМО первоначально локализованы в ядерной плазме поздних миотических ооцитов профазы. Затем он перераспределялся в центральный кольцевой комплекс парных омологов, когда ядерный конверт сломался и хромосомы примыкались к метафазной пластине.
Параллельно с подготовкой гонады, помеченные kmUTAG-FL, выявили аналогичные закономерности. KmUTAG-FL перешла от маркировки нуклеоплазмы к концентрации на кольцевом комплексе, как яйцеклетки начали и завершили процесс распада ядерного конверта. Эти результаты подтверждают KmUTAG-FL в качестве полезного инструмента для анализа миоза и процессов, связанных с СУМО в c.
elegans и, возможно, другие нематоды. При выполнении фиксации крайне важно использовать свежий параформальдегид и короткое время фиксации, чтобы сохранить СУМО в штатном состоянии, чтобы его можно было распознать в КмУТАГ. Поскольку третичная структура SUMO очень сохраняется, весьма вероятно, что варианты SUMO из дополнительных модельных и не моделных систем могут быть проанализированы с помощью реагента KmUTAG-FL.
В настоящее время мы используем этот роман флуоресцентных SUMO-ловушки UTAG белка для изучения функции СУМО во время клеточного стресса. Наконец, обратите внимание, что все шаги с использованием фиксаторного параформальдегида должны выполняться в лабораторном защитном капюшоне, и этот реагент должен быть утилизирован должным образом.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается использование нового флуоресцентного белка-ловушки SUMO (kmUTAG) для детекции конъюгатов SUMO в различных эукариотических клетках. Этот метод позволяет осуществлять визуализацию SUMO без использования антител, что имеет решающее значение для понимания его роли при раке и нейродегенеративных заболеваниях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Модификация белков
Теоретические основы
- SUMO представляет собой малый убиквитин-подобный модификатор — белок с высокой степенью консервативности у разных видов.
- Он играет важную роль в различных клеточных процессах, включая ответ на стресс и локализацию белков.
- Надежные методы детекции SUMO-модифицированных белков необходимы для функционального анализа.
- В данном протоколе используется рекомбинантный SUMO-захватывающий белок для визуализации SUMO в различных типах клеток.
Цель исследования
- Предоставить простой метод обнаружения конъюгатов SUMO без использования антител.
- Продемонстрировать применение kmUTAG в клетках млекопитающих и ооцитах нематоды.
- Углубить понимание роли SUMO в процессах здоровья и развития заболеваний.
Используемые методы
- Флуоресцентное мечение SUMO с использованием белка kmUTAG.
- Визуализация конъюгатов SUMO в культуре тканей млекопитающих.
- Применение метода в гонадах нематод.
- Анализ локализации SUMO в различных эукариотических клетках.
Основные результаты
- Успешная визуализация конъюгатов SUMO в различных типах клеток.
- Демонстрация эффективности kmUTAG для детекции без использования антител.
- Данные о локализации и функциях SUMO-модифицированных белков.
- Потенциальные возможности применения в изучении роли SUMO при раке и нейродегенеративных заболеваниях.
Выводы
- Белок kmUTAG является ценным инструментом для детекции SUMO в различных организмах.
- Данный метод упрощает изучение биологических функций SUMO.
- Дальнейшие исследования могут использовать этот метод для изучения путей, связанных с SUMO, при нормальном состоянии и патологиях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Детекция модификаций SUMO без использования антител обеспечивает надежную валидацию мишеней в системах, релевантных для заболеваний, особенно в программах по онкологии и нейродегенерации, где SUMOилирование влияет на стабильность и функцию белков. Реагент kmUTAG представляет собой рекомбинантный межвидовой инструмент, который снижает вариабельность анализа и способствует снижению механистических рисков за счет прямой визуализации эндогенных конъюгатов SUMO в живых или фиксированных клетках. Этот подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет устранения артефактов, зависящих от антител, и обеспечения стандартизированного изучения пути SUMO в различных модельных системах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: Обеспечивает возможность прямого изучения SUMO-зависимой регуляции белков без влияния антител, что способствует проверке гипотез относительно мишеней в моделях рака и нейродегенеративных заболеваний.
- Практическая ценность: Рекомбинантное производство гарантирует воспроизводимость от партии к партии и масштабируемость для проведения высокопроизводительного скрининга, требующего анализа активности SUMO.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные показатели флуоресценции статуса конъюгации SUMO, что обеспечивает стандартизацию анализа изменений SUMOилирования, вызванных воздействием соединений.
- Практическая ценность: совместимость со стандартными методами микроскопии и фиксации позволяет интегрировать данный метод в существующие платформы клеточного анализа без использования специализированного оборудования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: облегчает проведение исследований по локализации SUMO у разных видов — от клеток млекопитающих до ооцитов нематод, что способствует согласованию трансляционных биомаркеров в консервативных путях стрессового ответа.
- Практическая ценность: применима для фиксированных препаратов тканей, что позволяет проводить ретроспективный анализ динамики SUMO в доклинических моделях заболеваний.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод подходит для использования в рамках ранних этапов поиска лекарственных средств, когда модуляция пути SUMO является механизмом действия, обеспечивая ортогональную валидацию биохимических или генетических исследований по нарушению функции SUMO перед оптимизацией соединений-лидеров.
- Биология открытий: обеспечивает поддержку скрининга на основе гипотез путем подтверждения таргетной конъюгации SUMO в ответ на модуляторы сигнальных путей или генетический нокдаун.
- Скрининг: позволяет воспроизводимо обнаруживать формирование фокусов SUMO в качестве фенотипического показателя в анализах высококонтентного скрининга.
- Аналитика: предоставляет количественные данные о субклеточной локализации (ядерная против цитоплазматической, диффузная против фокальной), которые могут быть коррелированы с воздействием соединений или генетическим фоном.
- Трансляционные исследования: демонстрируют консервативность паттернов транспорта SUMO у разных видов, что обосновывает экстраполяцию данных с моделей нематод на системы млекопитающих.
- Корпоративное использование: рекомбинантный kmUTAG-FL может быть помещен в банк и использоваться в различных отделах в качестве стандартизированного реагента для мониторинга пути SUMO.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает количество ложноположительных результатов при детекции SUMO за счет минимизации связывания со свободным SUMO, что повышает достоверность сигналов, специфичных для конъюгатов.
- Операционная ценность: Устраняет необходимость в закупке, валидации и титровании антител, сокращая сроки и стоимость разработки анализа.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) на основе прямой визуализации взаимодействия мишени с аппаратом SUMO, уменьшая механистическую неопределенность на ранних этапах проектов.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации соединений, модулирующих SUMOylation, с учетом рисков, предоставляя функциональные доказательства активности пути на основе локализации.
Особенности реализации
- Для правильной подготовки и визуализации образцов требуются навыки работы с культурами клеток, фиксации и флуоресцентной микроскопией.
- Метод зависит от наличия флуоресцентного микроскопа с соответствующими наборами фильтров для каналов DAPI и Texas Red.
- Маркировка ооцитов нематод требует предварительного обучения препарированию гонад, что ограничивает возможность быстрого масштабирования метода в неспециализированных лабораториях.
- Фиксация свежим параформальдегидом имеет решающее значение для сохранения третичной структуры SUMO, что требует стандартизированного обращения с реагентами на всех участках работы.
- Несмотря на эффективность в клетках млекопитающих и C. elegans, для новых модельных систем может потребоваться эмпирическая проверка совместимости с kmUTAG-FL.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
1:04
SUMO Detection in Fixed Tissue Culture Cells Using Recombinant KmUTAG-FL SUMO-trapping Protein
3:42
Results: Use of a Fluorescent Sumo-trapping UTAG Protein to Detect SUMO in Mammalian Cells and in C. elegans Oocytes
5:30
Conclusion
