Масса на основе спектрометрии протеомики анализа с использованием базы данных OpenProt откроет новые белки перевод с неканоническим открытом чтения фреймов

OpenProt является первой базой данных, которая позволяет полисизотронную аннотацию эукариотических геномов, распознает кодирующий потенциал протогенов и позволяет обнаружить ранее необнаруживаемые белки. Мы разработали этот протокол таким образом, чтобы он был доступен для всех пользователей, не требуя обширных биоинформатических навыков Он по существу помещает протеомные открытия в пределах досягаемости любого. Чтобы понять и решить сегодняшние вызовы в медицине, мы должны в полной мере понять протеомный ландшафт и всех актеров и их динамику.

OpenProt предоставляет такую возможность. Хотя здесь OpenProt используется для анализа патономических экспериментов, он также может быть использован с другими системами, поскольку он просто обеспечивает более четкое определение протеома. Начните с открытия веб-сайта OpenProt и используя ссылку из меню верхней страницы, чтобы открыть страницу загрузки.

Нажмите на виды, представляющие интерес на основе экспериментальных данных анализа и желаемого типа белка. Нажмите AllProts, Isoforms и RefProds для создания файлов, содержащих все известные и новые типы белков, присутствующих в базе данных OpenProt, и, если таковые имеются, нажмите на аннотацию, из которой взяты белковые последовательности. Нажмите на уровень подтверждающих доказательств, необходимых для рассмотрения белка в соответствии с целью исследования.

Затем нажмите кнопку, все предсказал для создания файлов, содержащих все прогнозы OpenProt и нажмите на желаемый формат файла для загрузки. Для протеомных анейсов выберите белок-файл FASTA. Файл readme будет содержать всю необходимую информацию о формате файла.

Для обработки баз данных войдите в соответствующий экземпляр инструмента протеомика и создайте новую историю. Чтобы импортировать загруженную базу данных OpenProt, нажмите Upload. Чтобы ввести рабочий процесс обработки базы данных, перейдите на страницу рабочего процесса, нажмите Загрузить снова и нажмите запустить рабочий процесс.

Затем выберите импортированную базу данных OpenProt в качестве ввода и переименуем полученный файл Fasta во что-то значимое. База данных готова к использованию для протеомического анализа. Для подготовки файла масс-спектрометрии откройте свободно доступный инструмент преобразования MS из набора мастеров proteo и загрузите файл данных для анализа.

Выберите каталог для вывода и установите желаемый формат файла для mzML, затем используйте алгоритм волновой волны на основе уровней масс-спектрометрии один и два, чтобы выбрать фильтр пикового выбора и начать преобразование. Для количественной оценки белка создайте новую историю и перетащите и уроним ранее созданную базу данных в новую историю. Нажмите Загрузите, чтобы импортировать преобразованный файл данных mzML.

Откройте страницу рабочего процесса, нажмите Загрузите еще раз, чтобы импортировать желаемый рабочий процесс, и выберите запустить рабочий процесс для рассмотрения различных параметров. Выберите импортированный файл данных mzML и вввемит ранее созданную базу данных в качестве файла базы данных Fasta. Так как рабочий процесс использует X!

Тандем поисковой системы, нажмите Загрузить импортировать X! Файл конфигурации тандема по умолчанию. Для учета существенного увеличения размера при использовании всего OpenProt databse используйте строгую скорость ложных открытий.

Для контроля качества запустите инструмент информации о файле на выходе фильтра ID, чтобы обеспечить общие показатели производительности, такие как количество совпадений пептидного спектра или количество идентифицированных пептидов и белков. Для майнинга базы данных OpenProt вернитесь на веб-сайт OpenProt и откройте страницу поиска. Нажмите на виды, представляющие интерес, для которых был идентифицирован белок, и введите номер присоединения белка в поле запроса белка.

Нажмите всплеск и таблица, содержащая основную информацию для запрошенного белка появится. Далее нажмите на подробную ссылку. Недавно открытая страница будет содержать браузер генома, который сосредоточен на запрошенный белок, а также другую информацию.

Чтобы получить белок или последовательности ДНК, нажмите на белок или ДНК ссылки из информационных вкладок, соответственно Затем нажмите на вкладки, чтобы просмотреть подробную информацию о масс-спектрометрии доказательства рибосомного профилирования обнаружения, а также сохранения и выявления белковых доменов. В этом репрезентативном анализе большинство белков, выявленных в оригинальной статье, были также идентифицированы с использованием базы данных OpenProt 2_pep или базы данных OpenProt_all, что показывает, что базы данных OpenProt способны производить идентификацию белка и количественную оценку, сравнимую с текущими процедурами, основанными на базах данных InterPro KB. 11 хорошо поддерживаемых белков, еще не аннотированных в базах данных, были идентифицированы во всех наборах данных с уверенными пептидами с использованием базы данных OpenProt 2_pep данных.

29 новых белков были обнаружены во всех наборах данных с уверенными пептидами с использованием OpenProt_all данных. Рекомендуемая строгая скорость ложных открытий не повлияла на наиболее уверенную идентификацию белка, хотя и снизила общее количество выявленных белков. Один новый белок был обнаружен в качестве взаимодействующих белка Raf-1.

Эти белки ранее не были обнаружены при масс-спектрометрии или рибосоме профилирования и продемонстрировали хорошее качество спектра. Не забудьте убедиться, что выбранные параметры адекватны экспериментальному дизайну и всегда проверяйте качество спортивных доказательств при сообщении о новых открытиях белка. Этот протокол адаптируется ко всем экспериментам протеомика сверху вниз, особенно при использовании с функциональной протеомией.

Это позволит продать много глубокого скрининга и понимания белковых взаимодействий и клеточных путей. OpenProt подчеркивает существенную недооценку протомического ландшафта, передаваемого современными геномными нотациями, и подчеркивает полисистронную природу эукариотических генов. Это совершенно новый путь для исследований.

Красота этого протокола заключается в том, что он не требует обширных биоинформатических навыков и что, поскольку он использует удаленные серверы, он может работать на любом компьютере.