Изучение пространства последовательности для определения связывающих сайтов для регулятивных РНК-связывающих белков

Протокол используется для насыщения мутагенезом белково-связывающего участка. Если ваш сайт связывания белков не известен, его можно определить с помощью этого протокола. Методика имеет отношение к диагностике и терапии заболеваний.

Я считаю, что его полный потенциал в биомедицинских науках еще предстоит в полной мере использовать. Этот метод может быть широко применен к любому белку или реакции, где желаемые молекулы могут быть отделены от нежелательных молекул. Убедитесь, что библиотека правильно рандомизированы, и убедитесь, что во время каждого связывания и разделения шаг раза обогащения желаемых молекул высока.

Она включает в себя несколько шагов и многие детали, которые лучше продемонстрировать, а не объяснить словами. После просмотра этого видео, вы должны быть комфортно с тем, как подготовить случайную библиотеку, синтезировать стартовый бассейн РНК, и выполнять связывающую реакцию на отдельные желаемые и нежелательные молекулы, чтобы получить высокое сродство и конкретные связующие. Во-первых, синтезировать перемотка вперед и обратной грунтовка путем химического синтеза на синтезаторе ДНК.

Кроме того, синтезировать случайные библиотеки олигонуклеотид шаблон с 31 рандомизированных позиций. В ПЦР-трубке смешайте одномимолярный шаблон случайной библиотеки ДНК, одномимолярный вперед грунтовка, содержащая T7 РНК полимеразы промоутер и обратной грунтовки, 20-миллимолярный Трис на рН восемь, 1,5-миллимолярный хлорид магния магния, 50-миллимолярный хлорид калия, 1-микрограмм на миллилитр ацетилированного бычьего сыворотки альбумин, две единицы Taq полимеразы, и 200 микрограммов на миллилитр ацетилированного бычьего сыворотки альбумин, две единицы Taq полимеразы, и 200 микрограмм каждый из dNTPs. Настройка машины PCR с пятью циклами денатурации, annealing, и расширение шаги, а затем один цикл расширения, чтобы прикрепить промоутер к библиотеке ДНК.

Настройка 100-микролитровой транскрипционной реакции, содержащей буфер транскрипции T7, одномимолярную случайную ДНК пула библиотек, пятимилимолярный DTT, двухмилимолярный GTP, по одному миллимолару АТФ, CTP и UTP, а также полимеразу T7 T7 с двумя единицами на микролитр. Теперь на надеть акриловый стеклянный щит и перчатки. Введи радиоактивность, добавив 5 микролитров или меньше альфа-32P UTP в транскрипционной реакции для ауторадиографии.

Инкубировать реакционной смеси в микроцентрифуг трубки в течение двух часов при 37 градусов по Цельсию. Для гель-очистки РНК, подготовить 10%денатурации полиакриламинид гель. Загрузите образцы в колодцы геля.

Выставить гель на рентгеновской пленке, и определить расположение стенограммы на гель и вырезать гель ломтик. Поместите гель ломтик в центрифугу трубки и разбить на более мелкие кусочки с гомогенизатором отзыв. Добавьте буфер протеиназы K, чтобы погрузить кусочки геля.

Оставьте трубку на гайки, по крайней мере два часа при комнатной температуре. Затем вращайся в высокоскоростном микроцентрифуге в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы удалить гель мусора и восстановить буферный раствор. Добавьте равный объем фенола-хлороформа в трубку с супернатантом, вихрем и центрифугой.

Повторите экстракции с фенол-хлороформ еще раз, а затем с хлороформом еще раз. Затем смешайте аквеозную фазу буфера протеиназы K с 1/10 объемом трехмязыкного ацетата натрия при рН 5,2, 10 микрограммах тРНК или 20 микрограммах гликогена и от двух до трех томов этанола, хранящихся при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Оставьте трубку при температуре минус 80 градусов по Цельсию на один час.

Закрути трубку, содержащую раствор в течение пяти-десяти минут при четырех градусах Цельсия в микроцентрифуге. Отбросьте супернатант тщательно, и добавить 70% этанола для полоскания гранул РНК. Спин в течение двух-пяти минут.

Аспирировать этанол тщательно, и воздух сухой РНК гранулы. Затем добавьте 50 микролитров воды, обработанных DEPC, чтобы solubilize гранулы РНК. Оставьте образец при температуре минус 20 градусов по Цельсию для хранения.

Для связывания белка и РНК в объеме реакции 100 микролитров, сначала подготовить 10-миллимолярный гидрохлорид Tris при рН 7.5, содержащий 50-миллимолярный хлорид калия, одномимиловый DTT, 09-микрограмм на микролитр бычьего альбумин сыворотки, 5 единиц на микролитр РНК, 15-микрограмм-на-микролитр тРНК, и один миллимолярный EDTA. Затем добавьте 30 микролитров рекомбинантного белка ПТБ и 10 микролитров РНК из соответствующего бассейна. Поместите трубки, содержащие связывающие реакции, в температурный блок в течение примерно 30 минут при температуре 25 градусов по Цельсию.

Далее, дробировать связанную РНК от несвехой РНК через четыре раунда отбора и усиления. Во-первых, фильтровать 100-микролитер образца при комнатной температуре через нитроцеллюлозы фильтр прилагается к вакуумной многообразия. На фильтре остается РНК-белковый комплекс.

Стерильным лезвием бритвы нарежьте фильтр на фрагменты и вставьте его в центрифугу. Погрузите кусочки фильтра в буфер протеиназы K и поместите их на стакан минимум на три часа или на ночь, чтобы восстановить РНК. Чтобы депротеинизировать образец РНК, добавьте равный объем фенол-хлороформа, вихря, а затем центрифуги на высокой скорости в течение пяти минут при комнатной температуре.

Получить aqueous фазы, и экстракт с хлороформом снова. После этого смешайте супернатант с 1/10 объемом трехмолярного ацетата натрия при рН 5,2 и двух-трех томах абсолютного этанола. Оставьте трубку в морозильной камере минус 80 градусов по Цельсию на 30 минут, а затем центрифуга на высокой скорости в течение 10 минут.

Повторите стирки и сушки шаги с 70% этанола, и solubilize РНК в DEPC-обработанной воды. После первого раунда анализа связывания фильтра проведем еще три раунда. Далее выполните два раунда транскрипции, связывания и усиления, чтобы отделить фракции РНК, связанные с белком, от несвязанные фракции.

Precast родной 5%полиакриламид гель с 60-к-одному акриламид-бис-акриламид соотношение в 5x TBE буфера. Затем навеять реакцию связывания РНК-белка. Поместите гель в электрофорезное устройство, наполненное 5x буфером TBE, в холодную комнату при четырех градусах Цельсия.

Нанесите 250 вольт в течение 15 минут, и пипетка связывающей реакции в различных скважинах. Затем далее дробить связанную РНК от несвежим РНК, запуская электрофорез на 250 вольт в течение одного-двух часов. Затем подвергайте гель рентгеновской пленке и определите местоположение связанной РНК с помощью ауторадиографии.

Вырежьте ломтик геля с связанной РНК, и вставьте его в трубку. Измельчите ломтик геля и инкубировать в буфере протеиназы K в течение трех часов или на ночь. Повторите экстракции с фенол-хлороформ и хлороформ, как описано ранее.

Синтезировать кДНА из растворенного РНК. Подготовь 20 микролитров реакции, в том числе два микролитера буфера 10x RT, два микролитров обратной транскриптазы AMV, один микролитр обратной грунтовки, пять микролитров воды и 10 микролитров растворенного РНК. Инкубировать при 42 градусах по Цельсию в течение 60 минут.

Увеличь cDNA, используя от 20 до 25 циклов ПЦР, как описано ранее. Повторите процесс синтеза РНК, связывания белков и разделения белковых и несвязанные фракции. Для анализа связывания белков используйте анализ смены подвижности геля или анализ связывания фильтров для определения связывающей близости и специфичности выбранных бассейнов или отдельных последовательностей в каждом бассейне.

Используйте авторадиографию или фосфорный образец для обнаружения и количественной оценки полос в связанной фракции и несвежаемой фракции. Продолжить протокол с клонированием и выравниванием последовательности. В этом исследовании был достигнут успешный отбор-усиление.

Полипиримидиновый связывающий белок млекопитающих с 300-кратной более высокой концентрацией белка показывает едва обнаруживаемую привязку к нулевой последовательности бассейна, но высокое сродство к выбранному бассейну последовательности. Отбор-усиление успешно определены на РНК-связывающих белков с предпочтительным или консенсус обязательным сайтом. Добавление рекомбинантного ПТБ, который связывается с вверх по течению три премьер сращивания сайта, приводит к активации альтернативного или вниз по течению три премьер сращивания сайта.

В отличие от этого, добавление рекомбинантных hnRNP C приводит к репрессиям обоих трех-премьер сращивания сайтов. Добавление рекомбинантных общего фактора сращивания U2AF65 обратил вспять hnRNP C-опосредовано три премьер сращивания сайте репрессии. Важно помнить, что хорошая рандомизированная библиотека и надлежащие условия связывания, которые дают высокое обогащение складок на каждом шагу связывания, необходимы для успеха.

Для проверки результатов такого подхода можно использовать соответствующие функциональные анализы и тесты in vivo. В области экспрессии генов, функции многочисленных белков были изучены с помощью этой техники. При работе с полиакриламиндом и радиоактивной печатью для защиты важно использовать перчатки и радиоактивное уплотнение.