Микроманипуляции циркулирующей опухолевой клетки для молекулярного анализа вниз по течению и метастатического потенциального оценивания

Этот протокол особенно актуален, поскольку позволяет обнаруживать и выемку одиночных ячеек из пула смешанных ячеек для последующего анализа ниже по течению при одном разрешении ячейки. Основным преимуществом этого метода является возможность отделить отдельные циркулирующие опухолевые клетки, или КТК, от клеток крови для целого ряда анализов, которые требуют высокой чистоты. Начните с запуска программного обеспечения микроманипулятора и включение микроманипулятора.

Подключите микроманипулятор к компьютеру и нажмите Connect и Инициализируйте устройство, чтобы инициализировать роботизированную руку на стадии микроскопа. Очистите внешние и внутренние поверхности защитного шкафа этанолом и закройте защитный шкаф после каждой манипуляции машины, чтобы иметь возможность маневрировать устройством через компьютер. Установите новый 20-30 микрометровый стеклянный капилляр на роботизированной руке и масло системы флеша через систему, чтобы удалить любые пузырьки в трубе.

Заполните резервуар для стерилизации одним с 70% этанола, стерилизация бак два со стерильной нуклеазы свободной воды, и буферный бак со стерильной PBS Dulbecco в. Стерилизовать капилляр два раза с 70%этанола и заменить стерилизации бак один с стерилизацией бак два использовать функцию стерилизации для мытья капилляров в воде, по крайней мере три раза. В программном обеспечении микроманипулятора начните новый эксперимент и выберите тип эксперимента по подбору из автоматического и ручного режимов выбора.

Настройте лоток палубы, чтобы указать положения резервуара для стерилизации, буферного бака и лотка для депонирования, и установите температуру жидких резервуаров в выбранном лотке для депонирования до четырех градусов по Цельсию. Расположения ультра-низкой пластины крепления, содержащей выпущенный раствор КТК под микроскопом внутри микроманипулятора кабинета. Снимите крышку с тарелки и закройте шкаф.

Центрифуга 384-хорошо пластины, содержащей 20 микролитров КТК культуры среды на колодец, чтобы обеспечить, чтобы среда секвестрирована в нижней части каждой хорошо и поместить пластину в цель одно положение четырех градусов по Цельсию выбранного лотка для депонирования. Вручную выберите цель микроскопа для сбора и время экспозиции всех необходимых каналов. Выберите Show Well Navigator, чтобы визуализировать и выбрать тип пикапа пластины.

Затем откалибровать положение пикапа в середине колодец, содержащий раствор КТК без ячеек в центре поля зрения. Используйте датчик, чтобы мягко коснуться нижней части пластины капилляром и установить положение пикапа на 0,05 миллиметра над нижней частью пластины. Тщательно опустите роботизированную руку на 10 микрометров за один раз, чтобы избежать повреждения капилляров.

Выберите тип ячейки и параметры выбора. Для выбора одной ячейки выберите ручной режим. Используйте джойстик, чтобы перемещаться по стеклянной капиллярной в пределах хорошо и место капилляр на вершине одной ячейки интереса по крайней мере один миллиметр от границы хорошо.

Затем вручную добавить частицы и выбрать Pick Активированные частицы, чтобы начать сбор. Когда все клетки были собраны, центрифуга пластины осадок клеток в нижней части каждой хорошо. Био-амино-окрашивание антиэпителиальной клеточной адгезией молекулы антитела позволяет визуализировать раковые клетки в суспензии с точным отличием от CD45 положительных событий.

Точная изоляция КТК характеризуется стремлением только желаемой цели без окружающих загрязняющих клеток. Как и предположительно, кластеры КТК демонстрируют увеличение выживаемости по сравнению с одиночными КТК, что порождает клеточные колонии в течение 56 дней после изучения культуры в пробирке. Примечательно, что кластеры КТК также демонстрируют более высокий уровень распространения и, таким образом, достигают более высоких конечных числа клеток, что указывает на то, что прямой контакт с другими опухолевыми клетками влияет как на жизнеспособность опухолевых клеток, так и на скорость распространения.

Одноклеточное секвенирование РНК КТК, непосредственно изолированных от больных раком молочной железы, показывает Т-распределенное стохастичное встраивание одноклеточных клеток, полученных из одиночных КТК, кластеров КТК или кластеров белых кровяных клеток КТК. Не забудьте установить стеклянный капилляр, чтобы удалить пузырьки воздуха в жидкой системе микроманипулятора и откалибровать положение пикапа, чтобы обеспечить эффективный сбор одноклеточных. Одноклеточные клетки могут быть посеяны или дополнительно обработаны для секвенирования следующего поколения, чтобы позволить анализу ex-vivo и характеристике КТК в одноклеточном разрешении исследовать метастатический процесс.