Поколение индуцированных нейронных стволовых клеток из периферических моноядерных клеток и дифференциация к дофаминергическим нейронным прекурсорам для трансплантационных исследований

Этот протокол описывает метод перепрограммирования крови и моноядерных клеток нервных стволовых клеток, которые могут быть использованы для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона. Он предлагает аутологичный источник клеток для лечения нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, сроки, необходимые для преобразования в индуцированные нервные стволовые клетки и дифференциации желаемых типов клеток короче, чем для индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

Индуцированные нервные стволовые клетки обладают хорошей пролиферативной способностью и могут быть расширены перед применением. Так как iNSCs могут быть указаны в различных регионе конкретных нервных клеток, таких как нейроны спинного мозга или моторных нейронов, этот метод может быть продлен для лечения других неврологических заболеваний. Вся процедура занимает много времени, со всеми шагами, связанными и критические, так что визуальная демонстрация дает представление о том, как клетки выглядят и дает несколько советов, чтобы обеспечить успешное поколение желаемых клеток.

Для начала перенесите ранее изолированную периферическую венозную кровь в 50-миллилитровую коническую трубку и разбавьте ее равным объемом стерильного PBS Dulbecco. В другой 50-миллилитровой конической трубке приготовьте 15 миллилитров стерилизованной градиентной среды плотности. Наклоните трубку под углом 45 градусов и медленно и осторожно положите 30 миллилитров разбавленной периферической крови на градиент плотности.

Центрифуга трубки при 800 раз г в течение 15 минут при комнатной температуре с центрифугой тормоза установлен в выключеном положении. Аспирировать желтый, верхний слой плазмы, и отказаться от него. Используйте 10-миллилитровую пипетку для переноса белого, облачного тонкого слоя пленки, содержащего моноядерные клетки, в новую 50-миллилитровую коническую трубку.

Добавьте 30 миллилитров D-PBS в трубку с MNCs, и центрифугу при 600 раз g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После отказа от супернатанта добавьте 45 миллилитров D-PBS и повторно посовелите клетки. После центрифугирования трубки при 400 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, отбросьте супернатант.

Resuspend клетки с пятью миллилитров D-PBS, рассчитывать живые клетки с методом trypan синий исключение, выделить MNCs, необходимых для расширения, и заморозить оставшиеся клетки для использования в будущем. Днем минус 14, семена MNCs при плотности от двух до трех миллионов клеток на миллилитр на колодец из шести хорошо пластины с 1,5 миллилитров 37-градусный По Цельсию, предварительно нагревается MNC среды. Инкубация при 37 градусах по Цельсию, 5%углекислый газ в течение двух дней.

На день минус 11, используйте стерилизованную пипетку для сбора клеток со средой и передачи в новую 15-миллилитровую коническую трубку. Центрифуга в 250 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре, отбросить супернатант, и повторного перерасхода клеток в один миллилитр предварительно разогретой среды MNC. После подсчета жизнеспособных клеток с трипан синий, семена MNCs при плотности одного миллиона клеток на миллилитр в предварительно разогретой среде MNC в шесть хорошо пластины.

Инкубация при температуре 37 градусов по Цельсию, 5%углекислый газ в течение трех дней, и повторный сбор клеток, центрифугирование, и покрытие в среде MNC в дни минус восемь и минус четыре. Сендай вирус в этой процедуре является опасным, и все процедуры, связанные с вирусом Сендай должны быть выполнены в кабинете безопасности. И все советы и трубки, подвергшиеся воздействию вируса Сендай должны быть обработаны этанолом или отбеливателем перед удалением.

На нулевом дне соберите клетки в среде MNC и перенесите в 15-миллилитровую коническую трубку. После центрифугирования клеток в 200 раз г в течение пяти минут, аспирировать супернатант и повторного перерасхода клеток с одним миллилитр предварительно разогретой среды MNC. Подсчитайте жизнеспособные клетки с трипан-синим цветом, а затем повторно посчитайте их с предварительно разогретой средой MNC до концентрации 200 000 клеток на колодец в 24-хорошо пластин.

Оттепель труб удалены из минус 80 градусов по Цельсию хранения, содержащего вирус Сендай в 37-градусной водяной бане по Цельсию в течение пяти до 10 секунд, а затем оставить их оттаивать при комнатной температуре. После того, как оттаял, поместите их сразу на лед. Добавьте оттаявный вирус Сендай в скважины 24-хорошо пластины с MNCs при множественности инфекции 10.

Чтобы облегчить крепление клеток, центрифуга пластин на 1000 раз г в течение 30 минут и после этого место пластин в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию, 5%углекислого газа. В первый день перенесите клетки со средой в 15-миллилитровую центрифугу. Чтобы еще больше отсоединить оставшиеся клетки, промыть колодцы одним миллилитром среды МНК на скважину и добавить клетки со средним к трубе.

После центрифугирования клеточной суспензии при 200 г в течение пяти минут, аспирировать супернатант, повторно использовать клетки с 500 микролитров свежей предварительно разогретой среды MNC, и добавить в колодец 24-хорошо пластины. На второй день используйте один миллилитр на колодец ранее разбавленных 50 микрограмм на микролитр поли-D-лизин в D-PBS, чтобы покрыть шесть хорошо пластин, по крайней мере два часа при комнатной температуре. Аспират поли-D-лизина из шести хорошо пластин, и сухой на вертикальной чистой скамейке около 10 минут.

Затем добавьте один миллилитр на колодец ранее разбавленных пяти микрограммов на миллилитр ламинина в шесть пластин, и инкубировать в течение четырех-шести часов при 37 градусов по Цельсию, чтобы покрыть. Вымойте пластины с D-PBS перед использованием. На третий день, пластины всех Сендай вирус-трансфуцированных MNCs в индуцированной нервной стволовой клетки среды на поли-D-лизин / ламинин покрытием шесть хорошо пластин.

В дни пять и семь, осторожно добавить один миллилитр 37-градусный по Цельсию, предварительно разогретый iNSC среды для каждого хорошо из шести хорошо пластин. С 9-го дня до 28-го дня ежедневно заменяем среду свежей предварительно разогретой средой iNSC. Следите за появлением колоний iNSC, и примерно через две-три недели подберите колонии с соответствующей морфологией с использованием сгоревших стеклянных пипеток и перенесите каждую колонию в отдельный колодец из шести-хорошо пластины для расширения.

Для создания односторонних 6-гипоксидофамин-поражения мыши модели, брить голову анестезированных, взрослых, мужчин, SCID-бежевой мыши, и применять эритромицин глаз мазь. Поместите мышь на стереотаксис аппарата, и исправить мышь с резцом баров. Вставьте ушные чашки правильно, чтобы надежно и надлежащим образом распоставить голову мыши.

Стерилизовать голову с povidone йода и изопропилового спирта, а затем использовать лезвие скальпеля, чтобы сделать примерно 1,5-сантиметровый сагиттаальный разрез на коже головы, подвергая черепа. Отрегулируйте бар резцатора и ушные батончики, чтобы уменьшить разницу в высоте между брегмой и ламбдой до менее чем 0,1 миллиметра. Медленно двигайтесь и опустите кончик иглы микросыринга в сторону брегмы и относитесь к брегме как к нулевой точке.

Переместите наконечник в положение с координатами передней 0,5 миллиметра и боковой 2,1 миллиметра относительно брегмы. Увями кончик, отметь точку маркерной ручкой, и, с помощью электронного сверла, заусенец небольшое отверстие в черепе. Извлекайте два микролитера по пять микрограмм на миллилитр 6-гипоксидопанового раствора в микросиренг.

Верните иглу к отмеченной точке и вставьте иглу в спинной/вентальный 3,2 миллиметра. Ввимите 6-гипоксидопоматный раствор из шприца со скоростью одного микролитра в минуту, оставьте инъекцию иглы на месте еще на пять минут, а затем медленно втягивать ее. После закрытия разреза швами, нанесите эритромицин глаз мазь на глаза снова.

Удалите мышь из стереотаксисного аппарата, поместите ее в клетку восстановления и дайте доступ к пище и воде до тех пор, пока она не приходит в сознание. После того, как ПБМНК были инфицированы SeV, их морфология менялась, и клетки подверглись резкой смерти до пяти дня. Колонии INSC появились на 12-й день.

После сбора и передачи клонов iNSC для расширения для ряда проходов, они показали хорошую морфологию и могли самообновиться в среде iNSC, либо в форме монослойного, либо в качестве сфер. После 24 дней дифференциации, iNSCs были определены как дофаминергические нейроны, как большинство из них выразили гидроксилазы тирозина, вилочный ящик A2, и нейрон-специфический класс III бета-тубулин маркеров. После создания односторонних 6-гипоксидотамин-поражения болезни Паркинсона мыши модели, поведенческая оценка была проведена для оценки симптомов болезни Паркинсона.

Мыши, получившие трансплантацию клеток, показали значительное улучшение двигательной функции. Степень 6-гипоксидопамин индуцированных поражения была проверена посмертного иммунофлуоресцентного окрашивания для TH на стриатум, медиальный пучок forebrain, и substantia nigra pars compacta. TH-положительные сигналы были значительно восстановлены в стриатуме, где клетки были имплантированы, а также слегка восстановлены в SN. Через три месяца после трансплантации, среди выживших клеток, около 13,84% были TH-положительных дофаминергических нейронов.

Около 91,72% TH-положительных клеток выразили сирот ядерного рецептора, около 86,76% выразили FOXA2, и около 98,77% были ко-помечены G-белка в сочетании внутреннего выпрямителя калия. При укладке 30 мил разбавленной периферической крови на плотность градиента среды, пожалуйста, делайте это медленно и осторожно, чтобы не нарушить интерфейс градиента. Следует позаботиться, чтобы избежать повторного оттаивания и замораживания вируса Сендай, чтобы обеспечить высокую активность вируса.

При перепрограммировании периферических моноядерных клеток крови к индуцированным нервным стволовым клеткам, пожалуйста, внимательно наблюдайте за морфологией клеток каждый день. Кроме того, 6-гидроксидопотамин светочувствительный и чувствительный к температуре. Будьте осторожны, чтобы защитить раствор от света, и держать его на льду перед использованием.

После этой процедуры, можно продолжать изучать механизмы заболевания с помощью семейных PD пациента полученных дофаминергических нейронов в культуре. Можно также продолжать исследовать, как пересаженные клетки влияют на поврежденные нейронные цепи.