Широкоугольной однофотонной оптической записи в мозговых фрагментах с использованием чувствительных к напряжению красителя
20 июня 2019 г.
Мы внедряем воспроизводимый и стабильный метод оптической записи для ломтиков мозга с помощью чувствительных к напряжению красителя. В статье описывается напряжение чувствительных красителя окрашивания и записи оптических сигналов с помощью обычных гиппокампа срез препаратов.
Метод оптической записи с чувствительным к напряжению красителем считается идеальной технологией для визуализации работы мозга. Этот метод позволил нам зафиксировать нейропсихическую динамику в течение 12 часов, что дало нам представление о психической активности. Мы пытаемся расширить применение для обнаружения изменений цепи, вызванных химическими веществами на всех этапах развития, таких как ценное применение кислоты для матерей.
Техника уже хорошо зарекомендовала себя. Пожалуйста, попробуйте воспроизвести исследования, следуя методу, представленного здесь. Чтобы начать эту процедуру, погрузите обезглавленную голову в ледяной ACSF в хирургический лоток из нержавеющей стали.
Извлеките мозг в течение одной минуты и поместите его в стакан, содержащий охлажденный ACSF в течение пяти минут. Затем разделите секцию мозга в средней линии скальпелем и поместите оба полушария на блок 4%агара. Затем поместите блок мозга с обоими полушариями на блок 4%agar.
Протрите излишки ACSF из блока фильтровальной бумагой. Впоследствии нанесите суперклей на вибромную платформу. Поместите агар блок на него и протрите чрезмерное клей с фильтровальной бумагой.
Аккуратно нанесите небольшое количество ледяного ACSF из верхней части блока агара мозга, чтобы помочь укрепить избыток суперклея и предотвратить клей от покрытия мозга и тревожные нарезки. После этого зафиксировать платформу к виброме лоток и залить модифицированный ACSF. Установите вибром на медленной скорости и иметь частоту лезвия на максимальной настройке.
Тогда начните нарезку. Поместите ломтики в углу среза камеры в последовательности, так что порядок ломтиков можно легко отличить. Обычно три-пять ломтиков можно получить из одного полушария.
Затем, отрезать часть ствола мозга с помощью 30 калибровочных иглы. Используя небольшую наконечником кисть краски, поместите ломтик на мембранный фильтр, удерживаемый с плексигласовым кольцом. Поместите кольцо во влажную восстановительную камеру и закрете крышку, чтобы держать внутреннее давление высоким.
При размещении ломтик на мембранный фильтр, настроить направление и положение ломтик в кольцо, чтобы убедиться, что он хорошо по центру и имеет последовательное направление. Оставьте образец при температуре 28 градусов по Цельсию на 30 минут, а затем при комнатной температуре, по крайней мере, от 10 до 30 минут для восстановления. Чтобы испачкать ломтики, аккуратно нанесите 100 микролитров раствора окрашивания на каждый ломтик и инкубировать при температуре 20 минут для комнатной температуры.
Затем приготовьте от 50 до 100 миллилитров ACSF в контейнере. Поместите кольцо с образцом в нем, чтобы промыть окрашивание раствора. Затем перенесите промытые ломтики в другую инкубационую камеру.
Подождите более часа для восстановления перед экспериментом. Чтобы начать эту процедуру, включите усилитель, компьютер и камеру системы и открыть программное обеспечение. Налейте ACSF в 50 миллилитровую трубку и пузырь его карбогеном.
Используйте перистальтический насос для циркуляции ACSF и корректировки скорости потока примерно до одного миллилитра в минуту. Затем отрегулируйте высоту всасывающей пипетки так, чтобы уровень жидкости внутри экспериментальной камеры всегда был постоянным. Поместите наземный электрод в камеру.
Впоследствии заполните стеклянный электрод небольшим количеством ACSF и поместите его в держатель электрода. Прикрепите держатель к стержню манипулятора. Используя усилитель, убедитесь, что сопротивление электрода составляет примерно один мегаом.
Во время записи перенесите кусочек из влажной камеры в экспериментальную камеру. Прижимай край кольца твердо в силиконовое о-кольцо. Будьте осторожны, чтобы не сломать мембрану или нижней части экспериментальной камеры.
Под микроскопом поместите кончик стимулирующего электрода и поле потенциальной записи электрода на ломтик. Проверьте вызванный ответ, поставляя стимул. Подтвердите, что поле зрения охватывает правильную нейронную цепь в оптической системе записи.
Затем отрегулируйте интенсивность возбуждения света примерно до 70-80% от максимальной емкости камеры. Используя флуоресцентный источник света, отрегулируйте фокус с системой приобретения. Затем начните запись и проанализируйте данные в программном обеспечении для получения изображений после приобретения.
На этом рисунке показан репрезентативный оптический сигнал при электрической стимуляции шаффер-колламерола в области CA1 мышелового гиппокампа. Эти последовательные изображения показывают оптический сигнал, прежде чем какие-либо пространствевые и временные фильтры были применены в то время как эти изображения показывают те же данные после применения пять на пять кубических фильтров в два раза. Из-за высокой частоты кадров и высокого пространственного разрешения, применение фильтра не изменило сигнал, но отфильтровыв шум, который также можно наблюдать в ходе времени, записанного в пикселях в одной пробной версии.
Вот сравнение типичных ответов в области CA1 гиппокампа ломтиками между мышью и крысой. Небольшая гиперполярная реакция наблюдается в дистальной стороне CA1 после 24 миллисекунд в ломтике гиппокампа мыши, но более массивный гиперполяризирующий ответ догнал деполяризирующий ответ в ломтике гиппокампа крысы. После того, как ломтики окрашены, они должны длиться более 12 часов, и вы можете выполнять другие электрофизиологические записи на них.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод стабильной оптической регистрации с использованием вольтаж-чувствительного красителя для срезов головного мозга, ориентированный на изучение сигналинга нейронов гиппокампа. Этот метод обеспечивает надежное наблюдение за нейропсихической динамикой в течение длительных периодов времени, что облегчает исследование изменений в нейронных цепях, вызванных воздействием химических веществ.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Электрофизиология
- Оптическая визуализация
Теоретические основы
- Вольт-чувствительный краситель имеет решающее значение для визуализации активности мозга.
- В качестве биологической модели используются стандартные препараты срезов гиппокампа.
- В исследовании изучаются нейропсихические динамики и изменения в нейронных цепях.
- Предыдущие методы не обладали достаточной надежностью при длительном времени записи.
Цель исследования
- Представить воспроизводимый метод оптической регистрации в срезах мозга.
- Предоставить данные о влиянии химических веществ на динамику мозговых цепей.
- Обеспечить возможность долгосрочного наблюдения за нейронной активностью и ответами.
Используемые методы
- В качестве платформы используются срезы мозга мыши ex vivo, приготовленные из гиппокампа.
- Основная модель включает срезы гиппокампа, что облегчает исследование электрической активности.
- Рабочие процессы мультиомики не упоминаются; основное внимание уделяется оптическим и электрофизиологическим методам.
- Процедура подготовки включает такие тщательные этапы, как охлаждение, окрашивание и инкубация срезов.
- Сеансы записи проводятся в экспериментальной камере с точными требованиями к настройке.
Основные результаты
- Оптический метод позволяет надежно собирать данные в течение 12-часового периода.
- Сравнение ответов срезов гиппокампа мыши и крысы демонстрирует различные нейрофизиологические профили.
- Электрофизиологические изменения, такие как гиперполяризующие ответы, подтверждаются данными оптических записей.
- Данная методика расширяет наше понимание динамики нейронных сетей при различных условиях.
Выводы
- Данный метод представляет собой значительный шаг вперед в изучении мозговых цепей и нейропсихических явлений.
- Он позволяет исследователям наблюдать изменения нейронной сигнализации в режиме реального времени.
- Понимание этих механизмов может дать представление о пластичности и потенциальных терапевтических возможностях применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Полнопольная однофотонная визуализация с использованием вольт-чувствительных красителей позволяет проводить стабильную долгосрочную функциональную оценку нейронных цепей в срезах мозга, что решает одну из ключевых проблем валидации мишеней в нейробиологии. Данный метод способствует снижению механистических рисков, обеспечивая количественное оптическое считывание активности нейронов с высоким разрешением в течение длительных периодов, что имеет решающее значение для оценки влияния соединений на динамику цепей в ходе доклинических исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации динамики нейронной сигнализации в гиппокампальных цепях в режиме реального времени.
- Эксплуатационная ценность: обеспечивает стабильную и воспроизводимую запись в течение более 12 часов, что позволяет проводить лонгитюдную оценку взаимодействия с мишенью и модуляции путей.
- Прогностическая ценность: облегчает обнаружение изменений в нейронных цепях, вызванных применением химических веществ, что способствует раннему выявлению эффектов нейроактивных соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Обеспечивается частота кадров 10 kHz и разрешение 100x100 пикселей, что позволяет проводить высокопроизводительный временной и пространственный анализ нейронных ответов.
- Качество сигнала: Фильтрация после записи повышает отношение сигнал/шум, обеспечивая надежное обнаружение подпороговых изменений в цепях, что критически важно для чувствительности анализа.
- Воспроизводимость: Стабильные протоколы работы со срезами и окрашивания сводят к минимуму механические артефакты, обеспечивая согласованность данных между повторностями и экспериментальными сессиями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: позволяет оценивать изменения нейронных цепей в сетях гиппокампа — области, вовлеченной в развитие когнитивных и нейропсихиатрических расстройств.
- Трансляционная преемственность: обеспечивает возможность параллельной оптической и электрофизиологической регистрации, что усиливает валидацию функциональных результатов с помощью различных методов измерения.
- Прогресс с учетом рисков: различия в профилях ответа срезов мозга мышей и крыс дают информацию для трансляции результатов между видами и помогают снизить риски при отборе доклинических кандидатов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска лекарственных средств, обеспечивая функциональный считываемый отклик нейронных цепей, который служит связующим звеном между валидацией мишени и идентификацией ведущих соединений, особенно для нейроактивных соединений, требующих фенотипической оценки на уровне цепей.
- Открытия в биологии: Обеспечивает проверку гипотез о нейропсихической динамике и уточнение сигнальных путей посредством прямой визуализации вызванных оптических сигналов в определенных нейронных цепях.
- Скрининг: Предоставляет количественные оптические данные высокого разрешения, подходящие для автоматизированного анализа и сравнения изменений нейронной активности, вызванных воздействием соединений.
- Аналитика: Позволяет применять пространственно-временные фильтры для выделения сигнала из шума, что способствует объективной количественной оценке ответов цепей и анализу вариабельности.
- Трансляционные исследования: Связывает наблюдения за нейронными цепями на этапе открытия с доклинической валидацией, позволяя проводить повторные записи в течение длительного времени для оценки стабильности и воспроизводимости эффектов соединений.
- Корпоративное повторное использование: Стандартизированная подготовка срезов и платформа визуализации поддерживают повторное использование в нескольких проектах и сериях соединений, снижая методологическую вариабельность в каскадах нейробиологического скрининга.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает понимание механизмов функционирования нейронных сетей, снижая неопределенность при валидации мишеней и повышая прогностическую достоверность нейрофармакологического скрининга.
- Операционная ценность: поддерживает физиологические условия и предотвращает смещение срезов, обеспечивая стабильный сбор данных без артефактов для надежного скрининга соединений.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет раннего выявления побочных или нежелательных эффектов в нейронных сетях, что снижает риск неудач на поздних стадиях разработки препаратов для ЦНС.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию соединений с учетом рисков на основе функциональных профилей нейронных сетей, повышая эффективность использования капитала в доклинических разработках.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области электрофизиологии, оптической визуализации и работы с тканями для обеспечения жизнеспособности срезов и эффективности окрашивания.
- Метод зависит от наличия высокоскоростных систем камер, источников флуоресцентного света и установок для перфузии, способных поддерживать физиологические условия в течение длительных записей.
- Необходима стандартизация ориентации срезов, продолжительности окрашивания и протоколов восстановления между исследовательскими группами для минимизации вариабельности базового уровня оптического сигнала и его отклика.
- Адаптация метода для других областей мозга или моделей заболеваний может потребовать валидации эффективности окрашивания и экспрессии сигналов в конкретных нейронных цепях.
- Практические ограничения включают необходимость тщательной оптимизации интенсивности возбуждающего света для предотвращения фототоксичности при сохранении амплитуды сигнала, достаточной для детектирования.
