Количественная флуоресценция в ситу Гибридизации (FISH) и иммунофлуоресценции (ИФ) специфических генных продуктов в KSHV-зараженных клетках

Протокол полезен для получения количественного понимания временной регуляции вирусных генных продуктов, в контексте клеток-хозяйских, особенно в отношении вирусов герпеса. Этот метод может помочь решить исследовательские вопросы, связанные как с принимающей и вирусной РНК и белков. Кроме того, этот метод совместим с одновременными биохимическими анализами.

Чтобы прилипнуть к клеткам к восьми камерным слайдам, нанесите 200 микролитров присущей клетке подвески на каждую камеру стерильного, восьмикамерного слайда и дайте семенному росту в течение 12-24 часов при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. В конце инкубации, аспирировать супернатантных и непривязанных клеток, и сразу же исправить клетки с предварительно охлажденным 4%формальдегида в PBS на льду, в течение 30 минут. В конце фиксации, мыть клетки с тремя, пять минут моет в 200 микролитров 4 градусов по Цельсию PBS за стирку.

После последней стирки пронизывают фиксированные клетки 200 микролитров предварительно охлажденных 0,5%Triton-X в PBS на колодец, в течение 10 минут на льду. В конце протеабилизации, тщательно удалите камеры, не растрескивая слайд, и промыть клетки с предварительно охлажденным PBS. Блок промыть клетки с предварительно охлажденным 4%BSA в PBS в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию, а затем инкубации с соответствующими поликлональных первичных антител интереса в 0,1%BSA в PBS в течение одного часа, при четырех градусах по Цельсию.

В конце инкубации, мыть клетки три раза со свежими PBS и инкубировать клетки с соответствующим вторичным антителом, конъюгированных с флюорофорной совместимы с FISH обнаружения антител в течение одного часа, при четырех градусах цельсия. После трех pbs моет, как попродемонстрировано, исправить образцы снова в 4%формальдегида в PBS в течение 10-15 минут до второй permeablization как попродемонстрировано. Затем накройте слайд алюминиевой фольгой, чтобы сохранить флуоресцентный сигнал и предотвратить фотоотбел.

И мыть клетки с 2x солевым цитратом натрия, прежде чем применять 45 микролитров раствора гибридизации. После одного часа при 37 градусах по Цельсию во влажной камере, добавить дистиллированной воды в антисенсе олигонуклеотидов интерес довести объем денатурации до 10 микролитров. Денатурации олигонуклеотидов при 95 градусах по Цельсию в течение пяти минут, прежде чем добавить 35 микролитров свежего раствора гибридизации на слайд.

Затем инкубировать образцы от 10-24 часов в увлажненной камере при 37 градусах по Цельсию, защищенных фольгой. На следующий день, мыть клетки с двумя, 10 минут. 2X солевой цитрат натрия моет при комнатной температуре, а затем один мыть в 1X солевой цитрат натрия в течение 10 минут, при температуре 25 градусов по Цельсию.

После последней стирки, исправить клетки с предварительно охлажденным 4%формальдегида в PBS, в течение 10-15 минут на льду, а затем три моет со свежим PBS. Далее, пронизывают образцы, как попродемонстрировано, а затем инкубации с антидиоксигенина FTC и предварительно охлажденных 0,1% BSA в PBS, в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации, мыть слайды три раза в свежем PBX, и исправить образцы с предварительно охлажденным 4%paraformaldehyde в PBS, в течение 10-15 минут при четырех градусах по Цельсию.

После трех моет в PBS, этикетка ядра с 0,4 микрограмма на миллилитр DAPI и предварительно охлажденных 0,5%Triton-X в PBS в течение 15 минут на льду, а затем три окончательных моет в PBS. Гора скользит с флуоресцентными бусинками, как экспериментально релевантные и в соответствующей монтажной среде. После удаления избыточной монтажной среды с помощью стерильных салфеток, печать один coverslip на каждом слайде с несколькими слоями ясно лака для ногтей, и использовать флуоресцентный микроскоп для подтверждения успешного выполнения эксперимента.

Изображения могут быть приняты на конфокальный микроскоп для сбора изображений образцов в течение часа до недели монтажа, в 630 раз больше. Эти репрезентативные результаты FISH и иммунофлюоресценции являются полуквантитивными и дают представление о локализации олигонуклеотида, а не в сравнении интенсивности различных флуоресцентных пятен, потому что эти эксперименты не включают флуоресцентную шарик в препарат слайда. В этих экспериментах цитоплазмические и ядерные области и их соотношения отличались для скрытых и литических инфицированных клеток КШВ.

Как показано на этом рисунке, область контролируется в нуклеоцитоплазме. Когда репликация ДНК KSHV ингибируется в литической фазе, ранний литический белок олигонуклеотидной транскрипта KSHV переходит к преимущественно цитоплазмической локализации. KSHV полиаденилатированных РНК, однако, локализуется на конкретных ядерных объектах, несмотря на ингибирование репликации вирусной ДНК.

При удалении камер со слайдов, заботиться о том, что есть очень мало клея остатков на инструменте, и использовать этанол для пермеаблизации клеток и ослабить клей. Биохимические анализы, такие как ПЦР, Западная помарка и секвенирование высокой пропускной способности, могут быть выполнены в тандеме для увеличения количественных данных, собранных с микрографов.