Поколение опухолевых органоидов из генетически модифицированных моделей мыши рака простаты

Мы показываем метод для некропсии и вскрытия моделей рака простаты мыши, фокусируя на рассечении опухоли простаты. Также представлен пошаговой протокол для генерации органов опухоли предстательной железы мыши.

Мышиные органоидные культуры больше напоминают организацию клеток in vivo, чем традиционные клеточные культуры. В исследованиях рака, органоиды модели оригинальной опухоли лучше, чем 2D клеточных линий и могут быть использованы для тестирования потенциальных методов лечения рака в пробирке для разработки новых методов лечения наркотиков. Для ан блок извлечения мужской мыши урогенитальной системы захватить жир площадку по обе стороны мочевого пузыря и тянуть вверх, чтобы разоблачить яичко.

Тщательно вскрыть каждое яичко от остальной части урогенитальной области. Аккуратно поднимите мочевой пузырь так, чтобы урогенитальная область была поднята вместе, обнажая уретру под ним. Удерживая мочевой пузырь, сориентировать ножницы против нижней части спинной простаты, чтобы склонить уретру.

Вся урогенитальная область будет освобождена из брюшной полости. После удаления урогенитальной системы, тазовые лимфатические узлы расположены сразу за урогенитальной системы и по обе стороны позвоночника будут подвергаться. Для удаления лимфатических узлов ориентируются прямые миппы под лимфатическую ткань и подтягиваются.

Далее, схватить прямую кишку с прямыми типсами и вырезать, потянув на прямой кишке, чтобы разгадать всю толстую кишку и тонкой кишки, чтобы искать метастатические поражения в мезентерио лимфатических узлов. Когда весь подвих был удален продолжают тянуть на двенадцатиперстной кости подвергать желудка. Вырезать пищевода, чтобы полностью удалить желудок.

Если наблюдаются метастатические повреждения лимфатических узлов, тщательно рассекают эти узлы вдали от кишечника для хранения в PBS. Когда желудок был удален, селезенка может быть собрана из спинной стороны живота для хранения в 4%paraformaldehyde. Удалите печень для хранения в PBS.

Удалите почки с обеих сторон позвоночника вместе с любыми почечных лимфатических узлов, содержащих метастатические поражения. Чтобы разоблачить грудной полости тщательно сократить диафрагму вдоль грудной клетки. Отрицательное давление, высвобождаемое в грудной полости, обнажит сердце и легкие.

Поднимитесь на грудину, чтобы открыть грудную полость дальше. Сканирование брюшной полости грудной полости вдоль грудной клетки для метастатических поражений в грудных лимфатических узлах для вскрытия, если таковые имеются. В то же время держа грудину, отрезать брюшной грудной клетки для доступа к сердцу и легким и подтянуть на сердце, чтобы сократить под легкими.

Для полного удаления сердца и легких ан блок сократить все передние кровеносные сосуды в трахее. Тщательно перенесите сердце, не повреждая легочную ткань или метастатические поражения легких в контейнер PBS. Для вскрытия опухоли предстательной железы поместите урогенитальный регион под микроскопом вскрытия.

Используйте пару прямых типсов и пару изогнутых типсов, чтобы перевернуть урогенитальный регион на спинную поверхность. Найдите проксимальную область простаты, которая может быть идентифицирована по розово-красному цвету уретры. Возьмитесь за уретру крепко, чтобы позволить манипуляции урогенитальной ткани с изогнутыми типсами.

Найдите основание семенных пузырьков, чтобы обеспечить их тщательное удаление. Затем используйте изогнутую сторону типсов, чтобы удалить ваз deferens и столько жирной и соединительной ткани, как это возможно. Хотя по-прежнему твердо проведения уретры и проксимальной области простаты, использовать пару тонкой отметил ножницы для удаления мочевого пузыря из уретры.

Холдинг проксимальной области простаты и уретры твердо с прямыми типсами захватить передней области простаты с изогнутой стороны типсов твердо вытащить ткани от мочевого пузыря и остальной части простаты. Поместите переднюю ткань простаты в PBS и найдите область брюшной простаты. Удалите область брюшной простаты таким же образом.

Если боковую область можно отличить от спинной области, удалите боковую область простаты с обеих сторон. Затем удалить спинной области простаты и место проксимальной области простаты в 4%paraformaldehyde. После заминки поместите кусочки опухоли в 15-миллилитровую трубку буфера пищеварения для полутора-двухчасового пищеварения при 37 градусах Цельсия.

В конце пищеварения, осадок переваренной ткани центрифугации и отказаться от супернатанта. Флик трубки, чтобы ослабить ячейки гранулы. Повторное использование клеток в одном миллилитре предварительно разогретого трипсина, дополненного 10 микромоляном ингибитором Y-27632 ROCK в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия.

В конце инкубации тритурат ткани суспензии пять раз со стандартным P1000 пипетки отзыв. Верните трубку на водяную баню еще на пять минут инкубации и тритурации. Для матричного купола покрытие мыть переваренные клетки в девять миллилитров холодной среды, а затем собирать клетки центрифугации.

Переусепенить клетки в один миллилитр свежей среды для подсчета. И после подсчета, собирать клетки центрифугации еще раз. Разбавить опухолевые клетки в соответствующем объеме матрицы.

Тщательно уронить 200 микролитров матричного клеточного раствора в каждую колодец 55 градусов по Цельсию, прогретую шести-хорошо пластиной. Разрешить купола затвердеть при комнатной температуре в течение двух минут, прежде чем поместить пластину вниз головой в 37 градусов по Цельсию инкубатор в течение 20 минут. Когда купола полностью затвердеют добавить два миллилитров простаты органоидной среды, дополненной андрогеном R1881 и ингибитором ROCK к каждому хорошо.

Верните тарелку в инкубатор клеточной культуры. Флуоресцентные изображения вскрытия показывают зеленый флуоресцентный белок, или экспрессию GFP, твердыми опухолями простаты, что указывает на то, что опухолевые клетки выражают Cre. Печень и легкие одного и того же животного обладают метастатическими опухолями, выражают GFP, демонстрируя, что эти опухоли возникли из первичной опухоли простаты.

Тазовый лимфатический узел от этой мыши выражает GFP, а не томат, указывая, что эта метастатическая опухоль обогнала лимфатический узел и не остается нормальной ткани. В первый день культуры небольшие органоиды, генерируемые из твердой опухоли предстательной железы начинают формироваться с помидорами и GFP-экспресс-экспрессии клеток, присутствующих в опухолевой органоидной культуры. На седьмой день и далее, когда органоиды опухоли предстательной железы полностью сформировались однако, органоиды выражают GFP, но не томат, предполагая, что органоиды возникли из Cre-экспрессии опухолевых клеток, а не из нормальных эпителиальных клеток.

В первый день культуры малых органоидов, порожденных жидкостью заполненные опухоли предстательной железы как томат и GFP-экспрессинг клетки присутствуют в органоидной культуры. Органоиды из заполненных жидкостью опухолей предстательной железы выразить либо GFP или томат на седьмой день и за его пределами, однако, указывая, что органоиды образуются из клеток, которые не выражают Cre. Чтобы оставаться ориентированным при сборе ткани простаты, быть в курсе мочевого пузыря и уретры позиции во все времена.

После их генерации органоиды могут быть использованы в визуализации приложений, молекулярной биологии анализа и наркотиков экранов.