Универсальный выборочный держатель для макромолекулярной рентгеновской кристаллографии с минимальным рассеянием фона

Этот держатель образца может быть использован для выращивания кристаллов и сбора рентгеновских данных дифракции. Этот держатель образца был сделан для использования на 24-хорошо пластин, которые широко используются в сообществе MX. Очень важным аспектом является то, что нет никаких манипуляций необходимо.

Владельца образца с этими аспектами, описанными здесь, раньше не существовало. Увидеть что-то всегда гораздо лучше, чем просто читать об этом. Посмотрев видео, потенциальный пользователь может сразу понять особенности и тонкости нового держателя образца.

Для начала создайте чистую и свободную от пыли поверхность с помощью влажной ткани без ворса. Возьмите один образец держателя из коробки и аккуратно поместите его, желтая фольга лицом вверх, на чистой поверхности, чтобы избежать повреждения или нежелательного прокола задней фольги COC. Настройка кристаллизации капель на желтую фольгу, как это было бы сделано на широко используемых слайдов покрытия.

Поместите капли осторожно, чтобы избежать разрыва или прокалывания фольги с помощью пипетки. На держателях образца типа 2 и типа 3 рекомендуемые максимум две капли. На держатель образца типа 1 можно поместить до трех капель.

Переверните держатель образца и поместите его на предварительно смазанную полость пластины в стиле Linbro. Используйте средства позиционирования держателя образца, чтобы вести его к оптимальному положению. Обеспечь правильное положение держателя образца, чтобы избежать нежелательного испарения.

Помещая кристаллизацию пластины под трансмиссионный микроскоп, без или без поляризаторов, контролировать рост кристалла без каких-либо нарушений эксперимента. Выполняем криопротезцию под световым микроскопом передачи. Аккуратно проколите внешнюю фольгу COC с помощью тонкой канулы.

Убедитесь, что внутренняя желтая фольга остается нетронутой. Прокол должен быть рядом с каплей, которой нужно манипулировать. Вставьте тонкий бумажный фитиль в ткнул отверстие.

Аккуратно нажмите фитиль вперед, пока он не коснется желтой полиимидной фольги. Держите фитиль в контакте с перфорированной фольгой. Фитиль будет отсосать все излишки раствора.

Время, необходимое для полного удаления жидкости, зависит от вязкости растворов и состава материнского ликера. После того, как вся жидкость высосется, аккуратно убирайте бумажный фитиль. Помните положение падения, так как оно может быть не видно после удаления материнского спиртного.

Возьмите стандартную пипетку, чтобы применить небольшой объем крио-защитного раствора, используя экструдированную наконечник через то же отверстие. Чтобы запечатать самовосстановляющуюся фольгу COC, аккуратно поместите защищенный палец на отверстие в течение одной секунды и сдвиньте его через прокол. Небольшое давление в сочетании с повышенной температурой будет способствовать повторному пропечатыванию проколов, которые не слишком велики.

Растворите лиганд в материнском ликере в нужной концентрации в реакционной трубке. Спин раствор в течение 10 минут при 12000 раз г для того, чтобы удалить нерастворимые частицы. При необходимости используйте центрифугу, контролируемую температурой.

Аккуратно поместите максимум три микролитера лигандсодержащего раствора в зазор между фольгой COC и полиимидной пленкой, используя длинный экструдированный наконечник пипетки; убирайте наконечник. Чтобы запечатать самовосстановляющуюся фольгу COC, аккуратно поместите защищенный палец на отверстие в течение одной секунды и сдвиньте его через прокол. Инкубировать эксперимент в течение некоторого времени, чтобы обеспечить диффузию через мембрану.

Время замачивания во многом зависит от вязкости диффузного раствора и его компонентов. Повторите лиганд замачивания шаги несколько раз, чтобы впоследствии впитать различные лиганды. Чтобы свести к минимуму рассеяние растворителей, удалите избыточное решение перед сбором данных.

Обеспечь стабильную, контролируемую влажностью среду луча с заранее установленными условиями. Для выполнения сбора данных на месте при температуре окружающей среды аккуратно поднимите прозрачную фольгу COC в назначенной точке с помощью типсов и снимите ее. Теперь аккуратно поднимите держатель образца из его полости и вставьте его немедленно в заранее подготовленную магнитную основу держателя образца.

Для этого шага не требуется клей. Нанесите мягкое давление, чтобы обеспечить правильное позиционирование держателя образца в пределах базы. Для держателей образцов со съемным внешним кольцом, применять мягкое давление, держась за внешнее кольцо и разорвать его в назначенных точках перерыва.

Образец готов к центру и сбору данных дифракции. Намонтировать держатель образца на гониометре луча и обеспечить правильное позиционирование держателя. В зависимости от геометрии гониометра, держатель образца может вращаться до 160 градусов, не вызывая никакой тени во время эксперимента дифракции.

Используйте бумажный фитиль и осторожно коснитесь желтой полиимидной фольги с задней стороны, чтобы удалить избыток материнского ликера. Образец готов к центру и сбору данных дифракции. Подготовьтесь к сбору данных на месте при криогенной температуре, как это делается для температуры окружающей среды, затем окунив образец в жидкий азот и перенесите его в совместимый с SPINE флакон.

Геометрия держательа образца типов 2 и 3 позволяет их перенос в стандартные флаконы образца SPINE, которые могут быть использованы для роботизированного монтажа образца. Тип держателя образца 1 и тип 2 были конструированы для того чтобы приспосабливать на наилучшим образом плиты 24-наилучшим образом Linbro-типа. Каждый отдельный держатель образца содержит средства позиционирования по обе стороны внешнего обода, чтобы обеспечить оптимальное позиционирование на краю хорошо.

24-хорошо Linbro стиле пластины был использован с типом 1 образца держатель для equilibrate падение на 293 Кельвин против 500 микролитров материнского ликера. Кристаллы от 40 до 50 микрон наблюдались через пять часов с помощью светового микроскопа передачи с поляризатором или без него. Образец держателя с куриным яично-белыми кристаллами лизозима был помещен в контролируемый влажностью воздушный поток на луче 14,3 H'B-MX.

Здесь отображается типичное дифракционное изображение. Никакого повышенного рассеяния фона на дифракционном изображении обнаружить нельзя. Крайне важно избегать загрязнения полиимидной фольги.

Кроме того, важно, чтобы держатель образца был расположен точно и кристалл манипуляции проводятся тщательно. Держатель образца позволяет обрабатывать очень деликатные кристаллы, один из самых важных шагов в микромолекулярной кристаллографии. Его использование значительно снижает вероятность уничтожения образца.