Анализ взаимодействия между эндобиотики и человека кишки микробиоты использованием в пробирке ванны системы брожения

Наш протокол может быть широко использован для высокой пропускной способности и быстрого скрининга взаимодействий между эндобиотиками и микробиотой кишечника человека. Низкая стоимость и избегание интерференционных эффектов от метаболизма хозяина. Эта процедура может быть использована в диагностике.

Во-первых, растворить BIF EPS и крахмал индивидуально в горячей воде на магнитном агитаторе, чтобы сделать как концентрация восемь граммов на литр. В подготовленной базовой среде культуры, VI, добавьте 100 миллилитров решения BIF EPS, чтобы сделать культуру VI BIF решение. Добавьте 100 миллилитров крахмального раствора, чтобы сделать раствор крахмала культуры VI.

Автоклав двух носителей с источником углерода, и среды без источника углерода в качестве контроля, на 121 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Дайте им остыть до комнатной температуры и добавьте сено и цистеин. Перенесите под образец из пяти миллилитров каждой среды в культурные трубки.

И хранить в анаэробной инкубатор. Храните оставшиеся средства массовой информации при четырех градусах цельсия. Чтобы подготовить фекальный образец человека, перенесите один грамм свежего фекального образца в 10 миллилитров 0,1 молярного анаэробного PBS при рН семь в стеклянном стакане.

Затем используйте стеклянный стержень, чтобы перемешать его для достижения суспензии. В анаэробной камере, добавить 500 микролитров фильтрованной фекальной суспензии в три подготовленных брожения средств массовой информации, индивидуально. Затем инкубировать при 37 градусах по Цельсию.

Через 24 часа и 48 часов соберите два миллилитров ферментированных образцов в анаэробной камере. А затем центрифуга за пределами камеры на 6000 раз G, в течение трех минут. Тщательно перенесите супернатанты в новые центрифуги, которые будут использоваться для анализа деградации полисахаридов и измерений короткокоголых жирных кислот.

Храните центрифугации гранулы при 80 градусов по Цельсию. Загрузите 0,2 микролитров ферментированных супернатантов на каждый предварительно покрытый кремнеземный гель 60 TLC алюминиевой пластины и вихрем для распространения. Затем используйте фен с горячим воздухом, чтобы высохнуть.

Погрузите один конец отобранных пластин в 20 миллилитров кремной кислоты:n-butanol: водный раствор в течение нескольких минут, пока электрофорез не распространится почти на другой конец. Затем вынули тарелки с типсами и высушите феном. Затем замочите тарелки в реагенте орцинола в течение двух минут, чтобы покрасить.

И снова высохнет. Перенесите тарелки в духовку при температуре 120 градусов по Цельсию, чтобы нагреть в течение трех минут. Затем сфотизуйте пластину, чтобы оценить деградацию EPS путем измерения полос TLC.

Для изучения влияния EPS на производство SCFA добавьте один миллилитр ферментированных супернатантов в двухми миллилитровые центрифуги и добавьте 0,2 миллилитров 25 вес/объем процентов метафосфорной кислоты к каждому образцу. Vortex тщательно перемешать решения. Центрифуга смеси на 13000 раз G в течение 20 минут.

А пока приготовьте растворы из 120 миллимоляонных ацетических, пропионных, бутириковых, изобутилических, валериковых и изовалерических кислот в трубках. Затем добавьте по миллилитр каждой подготовленной кислоты в трубку, содержащую 1,2 миллилитров метафосфорной кислоты весом/объемом. И загрузите их в образец бутылки газохроматографического инструмента в качестве стандартных коктейлей.

Возьмите трубки из центрифуги, и передать supernatants на свежие трубки. Используйте шприц, оснащенный фильтром 0,22 микрона для фильтрации супернатантов в новые трубки для анализа газохроматографии. В этом исследовании, производство слизистой ЭПС наблюдалось в бифидобактерий лонгум культур на пластинах PYG, после анаэробной инкубации в течение 72 часов.

Центрифугация культурных царапин, за которой следуют осадки этанолом и высыхание, привела к сбору целлюлозно-подобного ЭПС. Анализ TLC показал, что скорость деградации крахмала фекальной микробиотой человека была быстрее, чем у BIF EPS. Основной анализ координат показывает культуру VI BIF и группы крахмала культуры VI, сгруппированные отдельно друг от друга, что указывает на то, что наличие ЭПС и крахмала по-разному формирует фекальные бактериальные сообщества человека.

Линейный дисциплинарный анализ размера эффекта показывает, что генера коллинселла, копрококк, парабактериоиды и родопсеудомоны были значительно более обильны в культурах ОБРАЗЦОВ VI BIF, чем в культурах VI образцов крахмала. Кроме того, измерения ГК показывают, SCFAs, которые были измерены из ферментации культур включены уксусные, пропионические, изобутирик, бутирик, изовалерические и валериковые кислоты. После брожения в течение 24 часов и 48 часов, пять из шести концентраций SCFA были похожи и статистически не отличаются между культурой VI BIF, культурой VI крахмала и культурой VI групп.

Тем не менее, концентрации проприоновой кислоты были значительно выше в культуре VI BIF группы, чем в культуре VI крахмала группы, после 48 часов брожения. Сделайе этот эксперимент в анаэробных условиях, а затем перенесите фиксированные образцы в анаэробный инкубатор как можно скорее. Некоторые реагенты TLC опасны.

Вы должны быть осторожны, чтобы использовать их.