Анализ взаимодействия между эндобиотики и человека кишки микробиоты использованием в пробирке ванны системы брожения
23 августа 2019 г.
Описано здесь протокол для изучения взаимодействия между эндобиотики и кишечника человека микробиоты с использованием in vitro пакетных систем брожения.
Наш протокол может быть широко использован для высокой пропускной способности и быстрого скрининга взаимодействий между эндобиотиками и микробиотой кишечника человека. Низкая стоимость и избегание интерференционных эффектов от метаболизма хозяина. Эта процедура может быть использована в диагностике.
Во-первых, растворить BIF EPS и крахмал индивидуально в горячей воде на магнитном агитаторе, чтобы сделать как концентрация восемь граммов на литр. В подготовленной базовой среде культуры, VI, добавьте 100 миллилитров решения BIF EPS, чтобы сделать культуру VI BIF решение. Добавьте 100 миллилитров крахмального раствора, чтобы сделать раствор крахмала культуры VI.
Автоклав двух носителей с источником углерода, и среды без источника углерода в качестве контроля, на 121 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Дайте им остыть до комнатной температуры и добавьте сено и цистеин. Перенесите под образец из пяти миллилитров каждой среды в культурные трубки.
И хранить в анаэробной инкубатор. Храните оставшиеся средства массовой информации при четырех градусах цельсия. Чтобы подготовить фекальный образец человека, перенесите один грамм свежего фекального образца в 10 миллилитров 0,1 молярного анаэробного PBS при рН семь в стеклянном стакане.
Затем используйте стеклянный стержень, чтобы перемешать его для достижения суспензии. В анаэробной камере, добавить 500 микролитров фильтрованной фекальной суспензии в три подготовленных брожения средств массовой информации, индивидуально. Затем инкубировать при 37 градусах по Цельсию.
Через 24 часа и 48 часов соберите два миллилитров ферментированных образцов в анаэробной камере. А затем центрифуга за пределами камеры на 6000 раз G, в течение трех минут. Тщательно перенесите супернатанты в новые центрифуги, которые будут использоваться для анализа деградации полисахаридов и измерений короткокоголых жирных кислот.
Храните центрифугации гранулы при 80 градусов по Цельсию. Загрузите 0,2 микролитров ферментированных супернатантов на каждый предварительно покрытый кремнеземный гель 60 TLC алюминиевой пластины и вихрем для распространения. Затем используйте фен с горячим воздухом, чтобы высохнуть.
Погрузите один конец отобранных пластин в 20 миллилитров кремной кислоты:n-butanol: водный раствор в течение нескольких минут, пока электрофорез не распространится почти на другой конец. Затем вынули тарелки с типсами и высушите феном. Затем замочите тарелки в реагенте орцинола в течение двух минут, чтобы покрасить.
И снова высохнет. Перенесите тарелки в духовку при температуре 120 градусов по Цельсию, чтобы нагреть в течение трех минут. Затем сфотизуйте пластину, чтобы оценить деградацию EPS путем измерения полос TLC.
Для изучения влияния EPS на производство SCFA добавьте один миллилитр ферментированных супернатантов в двухми миллилитровые центрифуги и добавьте 0,2 миллилитров 25 вес/объем процентов метафосфорной кислоты к каждому образцу. Vortex тщательно перемешать решения. Центрифуга смеси на 13000 раз G в течение 20 минут.
А пока приготовьте растворы из 120 миллимоляонных ацетических, пропионных, бутириковых, изобутилических, валериковых и изовалерических кислот в трубках. Затем добавьте по миллилитр каждой подготовленной кислоты в трубку, содержащую 1,2 миллилитров метафосфорной кислоты весом/объемом. И загрузите их в образец бутылки газохроматографического инструмента в качестве стандартных коктейлей.
Возьмите трубки из центрифуги, и передать supernatants на свежие трубки. Используйте шприц, оснащенный фильтром 0,22 микрона для фильтрации супернатантов в новые трубки для анализа газохроматографии. В этом исследовании, производство слизистой ЭПС наблюдалось в бифидобактерий лонгум культур на пластинах PYG, после анаэробной инкубации в течение 72 часов.
Центрифугация культурных царапин, за которой следуют осадки этанолом и высыхание, привела к сбору целлюлозно-подобного ЭПС. Анализ TLC показал, что скорость деградации крахмала фекальной микробиотой человека была быстрее, чем у BIF EPS. Основной анализ координат показывает культуру VI BIF и группы крахмала культуры VI, сгруппированные отдельно друг от друга, что указывает на то, что наличие ЭПС и крахмала по-разному формирует фекальные бактериальные сообщества человека.
Линейный дисциплинарный анализ размера эффекта показывает, что генера коллинселла, копрококк, парабактериоиды и родопсеудомоны были значительно более обильны в культурах ОБРАЗЦОВ VI BIF, чем в культурах VI образцов крахмала. Кроме того, измерения ГК показывают, SCFAs, которые были измерены из ферментации культур включены уксусные, пропионические, изобутирик, бутирик, изовалерические и валериковые кислоты. После брожения в течение 24 часов и 48 часов, пять из шести концентраций SCFA были похожи и статистически не отличаются между культурой VI BIF, культурой VI крахмала и культурой VI групп.
Тем не менее, концентрации проприоновой кислоты были значительно выше в культуре VI BIF группы, чем в культуре VI крахмала группы, после 48 часов брожения. Сделайе этот эксперимент в анаэробных условиях, а затем перенесите фиксированные образцы в анаэробный инкубатор как можно скорее. Некоторые реагенты TLC опасны.
Вы должны быть осторожны, чтобы использовать их.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе исследуется взаимодействие между эндобиотиками и микробиотой кишечника человека с использованием систем периодической ферментации in vitro. Метод предназначен для высокопроизводительного и экспресс-скрининга, что позволяет минимизировать влияние метаболизма хозяина.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Здоровье кишечника
- Метаболомика
Обзор
- Эндобиотики играют важнейшую роль в здоровье человека.
- Микробиота кишечника оказывает значительное влияние на метаболические процессы.
- Понимание этих взаимодействий может помочь в диагностике.
- Современные методы могут быть ограничены влиянием метаболизма хозяина.
Цель исследования
- Разработать протокол для изучения взаимодействий между эндобионтами и микробиотой.
- Обеспечить возможность высокопроизводительного скрининга этих взаимодействий.
- Предложить недорогую альтернативу для проведения исследований.
Используемые методы
- Растворение ЭПС BIF и крахмала в горячей воде.
- Приготовление питательных сред для ферментации.
- Использование систем периодической ферментации для изучения взаимодействий.
- Мониторинг влияния эндобиотиков на микробиоту кишечника.
Основные результаты
- Успешное приготовление растворов ЭПС BIF и крахмала.
- Разработка надежного протокола ферментации.
- Демонстрация диагностического потенциала данного протокола.
- Изучение взаимодействий между эндобионтами и микробиотой.
Выводы
- Данный протокол представляет собой ценный инструмент для исследования микробиоты.
- Он может способствовать пониманию метаболических взаимодействий.
- Будущее применение метода может расширить возможности диагностики.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный протокол позволяет проводить высокопроизводительный и недорогой скрининг взаимодействий между эндобиотиками и микробиотой кишечника in vitro, что снижает зависимость от моделей на животных и сводит к минимуму влияние метаболизма хозяина. Он способствует валидации мишеней на ранних этапах, предоставляя количественные данные о сдвигах в микробном сообществе и выработке метаболитов, что имеет решающее значение для снижения рисков при разработке препаратов, модулирующих микробиом. Этот подход напрямую применим в рабочих процессах доклинических исследований, где понимание механизмов воздействия соединений на микробиоту определяет выбор ведущих соединений-кандидатов и принятие решений по портфелю разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать, как эндобионтики, такие как пребиотики или лекарственные препараты, модулируют сообщества бактерий кишечника человека, что способствует проверке целевых гипотез.
- Практическая ценность: использует общедоступные методы, такие как секвенирование 16S рРНК и количественное определение SCFA, для получения воспроизводимых и информативных с точки зрения механизмов данных.
- Прогностическая ценность: позволяет дифференцировать микробные ответы на структурно различные углеводы (например, ЭПС по сравнению с крахмалом), что помогает в оценке взаимосвязи «структура — активность».
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает стандартизированные условия анаэробной ферментации для последовательной оценки деградации соединений, опосредованной микробиотой.
- Практическая ценность: Совместим с высокопроизводительными форматами благодаря простой подготовке образцов и масштабируемым методам анализа, таким как ТСХ и ГХ.
- Готовность анализа: Позволяет получать количественные результаты (профили SCFA, сдвиги в составе сообщества), которые могут быть использованы для сравнения эффектов различных соединений в рамках скрининговых кампаний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: использование инокулята фекалий человека повышает релевантность физиологии по сравнению с моделями на животных.
- Снижение рисков на уровне механизмов: идентификация специфических микробных респондеров (например, Collinsella, Coprococcus) на эндобиотики подтверждает механизм действия, связанный с биомаркерами.
- Преклиническая преемственность: позволяет проводить дозо- и времязависимое профилирование (24ч/48ч) для определения окон безопасности и эффективности в последующих моделях.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум разработки препаратов — от валидации мишени до оптимизации ведущих соединений, что особенно актуально для соединений, активных в микробиоме, где понимание метаболизма, опосредованного микробиотой, имеет решающее значение для прогнозирования поведения препарата in vivo.
- Биология открытий: Обеспечивает проведение скрининга эндобиотиков на основе гипотез, связывая воздействие соединений с измеримыми изменениями в составе и функциях микробиоты.
- Скрининг: Позволяет проводить экспресс-оценку взаимодействий микробиоты, используя ТСХ для анализа деградации полисахаридов и ГХ для количественного определения SCFA в качестве ортогональных методов анализа.
- Аналитика: Позволяет получать многомерные данные (секвенирование 16S рРНК, концентрации SCFA), что дает возможность статистически сравнивать эффекты воздействия и выявлять значимые сдвиги.
- Трансляционные исследования: Использование микробиоты человека повышает прогностическую достоверность при переходе к клиническим исследованиям по сравнению с моделями на мышах.
- Корпоративное использование: Протокол адаптируем для различных эндобиотиков (лекарственных средств, пребиотиков, полисахаридов), что делает его универсальной платформой для различных терапевтических областей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижение механистической неопределенности во взаимодействиях между микробиотой и эндобиотиками за счет прямого наблюдения за паттернами деградации и микробным откликом.
- Операционная ценность: Низкая стоимость, анаэробный рабочий процесс и стандартизированный отбор проб повышают воспроизводимость и сопоставимость результатов между лабораториями.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает возможность более раннего принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет выявления метаболизма, опосредованного микробиотой, который может изменить эффективность или токсичность препарата.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию соединений с учетом рисков на основе их воздействия на полезную микробиоту и профили SCFA.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области анаэробной микробиологии и владение методами стерильной работы для сохранения целостности образцов.
- Необходим доступ к пластинам для ТСХ, газовому хроматографу и инфраструктуре для секвенирования 16S рРНК для проведения полного анализа.
- Стандартизация между лабораториями требует единообразного процесса обработки фекалий доноров и одинаковых условий анаэробного инкубирования.
- Адаптация метода для других эндобионтов требует проведения тестов на растворимость и стабильность в условиях ферментации.
- Практические ограничения включают вариабельность микробиоты доноров и необходимость осторожного обращения с опасными реагентами для ТСХ (например, орцинолом, муравьиной кислотой).
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Preparation of Fermentation Medium and Human Fecal Sample
1:48
In Vitro Batch Fermentation
2:33
EPS Degradation by Human Fecal Microbiota
3:29
Effects of EPS on SCFA (Short-chain Fatty Acids) Production by Human Intestinal Microbiota
4:41
Results: Degradation by Fermentation
6:24
Conclusion
