Инъекционные яйца Gryllus bimaculatus
22 августа 2019 г.
Здесь мы представляем протокол для введения крикет яйца, метод, который служит в качестве основополагающего метода во многих экспериментах в крикет, в том числе, но не ограничиваемся, РНК вмешательства и геномных манипуляций.
Этот метод служит основополагающим методом для экспериментов, направленных на анализ эмбрионального или личиночкового развития крикета. Основным преимуществом этого метода является то, что он является гибким и будет поддерживать несколько типов экспериментальных подходов, таких как использование РНК-интерференции или геномных манипуляций. Демонстрацией процедуры будет Хэдли Уилсон Хорч, главный исследователь в лаборатории.
Для начала этой процедуры промокнет вращающаяся плоскость мясорубки с капающей водой. Поместите вытянутую иглу в скошен и поверните ее под углом 20 градусов. Опустите иглу, пока она просто касается шлифовальной пластины и скошенной его в течение двух-трех минут.
Оцените скошенную, поместив скошенную иглу на двойную палку, которая была прилипла к слайду стеклянного микроскопа. Поместите слайд на сцену составного микроскопа, оснащенного камерой и программным обеспечением для получения изображений. Приобрети изображение иглы с помощью 20-х целей.
Используйте программное обеспечение для визуализации для измерения диаметра внутреннего люмена иглы просто проксимальной к скошенному отверстию. Откажитесь от любых игл с отверстием менее восьми микрометров или более 12 микрометров. Во-первых, сделать 40 миллилитров 1%agarose в воде и залить его в 10 сантиметров чашки Петри.
Поместите яйцо хорошо штамп на поверхности агарозы, прежде чем она затвердевает. Как только агароза затвердеет, снимите штамп, чтобы выявить скважины. Далее, заполнить агарозу хорошо пластины с HBS содержащие 1%пенициллин стрептомицин.
Поместите крышку на блюдо, оберните его в Parafilm и хранить его при четырех градусах по Цельсию. После этого заполните 35-миллиметровую чашку Петри белым песком детской площадки, чтобы сделать блюдо для сбора яиц для сверчков, чтобы отложить яйца дюйма Обложка яйцо блюдо с бумажным полотенцем площади сократить примерно до 18 на 18 сантиметров.
Заполните водопроводной водой через бумажное полотенце. Затем наклоните чашку Петри и аккуратно сожмите верхнюю часть, чтобы удалить избыток воды. Tuck углы бумажного полотенца площади под блюдом и поместите яйцо блюдо в перевернутой крышкой, которая поможет сохранить бумажное полотенце на месте.
Поместите яйцо блюдо в крикет бен и позволяют взрослым женщинамoviposit яйца в течение одного-двух часов. Между тем, дайте агарозе блюдо прогреться до комнатной температуры в рамках подготовки к проведению яйца для инъекций. Когда он будет готов, удалите блюдо для сбора яиц, которое теперь содержит свежеотложенные яйца, из ящика для крикета.
Снимите бумажное полотенце и поместите ситечко с размером поры от 0,5 до одного миллиметра над стаканом. Промыть содержимое яйца укладки блюдо в ситечко под мягко проточной водопроводной водой. Песчинки будут падать через ситечко сетки в стакан ниже в то время как крикет яйца остаются в корзине ситечко.
Заполните контейнер с обратной водой осмоса и поместите его в лоток. Переверните ситечко над контейнером и коснитесь его о блюдо, чтобы выбить яйца в воду. Яйца утонут на дно контейнера.
Далее, используйте ножницы, чтобы отрезать кончик наконечника P1000 пипетки, чтобы сделать отверстие примерно три миллиметра в диаметре. Поместите этот совет на P1000 pipetter, и использовать его для передачи яйца из контейнера в агарозы яичные формы блюдо. Используя пластиковые пинцеты, выстраивайте яйца в колодцы агарозы.
Каждое яйцо будет опускаться на дно отдельных хорошо. Накройте чашку Петри крышкой до готовности к инъекциям. Для начала поместите блюдо из яиц под рассечение микроскопа и выберите низкое увеличение около 10x.
Нарисуйте 1,5 микролитров инъекционного раствора с помощью 20 микролитров для загрузки и пипетки P10 и вставьте наконечник загрузки в широкий конец иглы для впрыска. Изгнать инъекционный раствор в инъекцию иглы. Вставьте иглу в инъекционный корпус и затяните, убедившись, что игла правильно и прочно вставлена в корпус.
Затем аккуратно вставьте инъекционный корпус в микроманипулятор, будьте осторожны, чтобы не сломаться или получить травму иглы. Глядя на яйца и иглу через микроскоп, переместить иглу возле X в верхнем левом углу сетки блюдо. Нижняя игла, пока кончик входит в HBS плюс пенициллин стрептомицин буферного раствора в блюде.
Центр иглы в поле зрения и переместить яйцо блюдо так, что игла на несколько миллиметров ближе к краю блюда, чем яйца. После этого установите микроскоп на фильтр, подходящий для родамина, чтобы наблюдать флуоресценцию в игле и сосредоточиться на ее кончике. На микроинъекторе медленно поверните ручку баланса по часовой стрелке до тех пор, пока раствор инъекции не начнет просачиваться из иглы в раствор подвески.
Затем поверните ручку назад против часовой стрелки немного, пока краситель просто перестает просачиваться из иглы. С иглой все еще центрируется в поле зрения, переместить яйцо блюдо так, что игла направлена на яйцо, которое будет введено в первую очередь. Отрегулируйте увеличение примерно до 50 раз, чтобы одно яйцо заполнял большую часть поля зрения.
Используйте как микроманипулятор, так и руку на яичном блюде, чтобы переместить иглу в положение для инъекции. Используйте микроманипулятор для продвижения иглы и вставить кончик в первое яйцо, которое будет введено, убедившись, что вставить иглу на 20 до 30% от длины яйца от задней части яйца перпендикулярно длинной оси яйца. Ввимите раствор либо педалью ноги впрыска, либо кнопкой впрыска на микроинжекторе.
Небольшой болюс флуоресцентного материала внутри яйца будет означать успешную инъекцию. После этого, втягивать иглу из яйца. Если яйцо непреднамеренно подняли из его хорошо на опровержение иглы, использовать небольшие миппы, чтобы подтолкнуть яйцо обратно в колодец при втягивания иглы.
В этом исследовании, крикет яйца вводят с использованием техники, которая служит основополагающим методом во многих экспериментах, в том числе, но не ограничиваясь, РНК-интерференции и геномных манипуляций. Выживаемость является одним из важных параметров для оценки успеха этого эксперимента. Большинство мертвых яиц можно легко определить на виду, как желток и эмбриональной ткани в яйце начинают слипаться неравномерно, и в конечном итоге большая часть желтка будет мигрировать в одну сторону яйца.
При оценке через четыре-шесть дней, более 85% нецелеприимных яйцеклеток выжили, в то время как яйца, введенные с экспериментальными реагентами, как правило, имели более низкую выживаемость. Контроль за всеми аспектами самой инъекции, включая прокол иглы, введение красителя и буфера, или наличие транспортного средства или двойной мель РНК, требуется для того, чтобы понять истинные последствия экспериментальной попытки манипуляции. Способ оценки фенотипических результатов инъекций зависит от того, что было введено.
Например, фенотипические изменения в результате конкретных нокдаунов мРНК могут быть очевидны на уровне валовой анатомии. Если с другой стороны, cDNA кодирования EGFP помечены гистона 2B гена под контролем G.bimaculatus actin промоутер вставляется в геном крикета с помощью контрейлерных транспозазы, становится возможным визуализировать каждое ядро в яйце с помощью флуоресценции, чтобы возбудить EGFP помечены ГИСТ 2B белка. Корректировка баланса таким образом, чтобы иглы не засоряли является важным шагом в этой процедуре.
Возможно, вам придется внести несколько корректировок после последующих инъекций, так как желток иногда забивает кончик иглы. Сверчок hemimetabolous насекомое которое ветвит базально к наилучшим образом изученным holometabolous насекомым such as Drosophila. Изучение развития крикета поможет нам лучше понять эволюцию и развитие в животном мире.
Этот метод требует некоторой практики. Мы рекомендуем практиковать контрольные инъекции до тех пор, пока выживаемость через четыре-пять дней после инъекции не будет не менее 80%
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол инъекций в яйца сверчка — базовый метод, используемый в различных экспериментах по исследованию сверчков. Эта техника особенно полезна для исследований, включающих РНК-интерференцию и геномные манипуляции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология развития
- Геномные манипуляции
Теоретические основы
- Яйца сверчка используются в различных экспериментальных подходах.
- Данная методика позволяет проводить исследования эмбрионального развития и развития личинок.
- Метод может быть адаптирован для различных планов экспериментов.
- РНК-интерференция является одним из ключевых направлений применения данного метода.
Цель исследования
- Продемонстрировать протокол инъекций в яйца сверчка.
- Предоставить базовый метод для будущих экспериментов со сверчками.
- Показать универсальность данной методики для различных областей исследований.
Используемые методы
- Смочите вращающуюся шлифовальную поверхность фасеточного станка водой.
- Поместите вытянутую иглу в станок под углом 20 градусов.
- Опустите иглу так, чтобы она коснулась шлифовальной пластины, и выполняйте заглаживание в течение 2-3 минут.
- Демонстрация Хэдли Уилсоном Хорчем, главным исследователем.
Основные результаты
- Данный метод эффективен для инъекций в яйца сверчка.
- Поддерживает различные экспериментальные подходы в исследованиях сверчков.
- Демонстрирует гибкость применения для РНК-интерференции и геномных манипуляций.
- Обеспечивает надежный метод изучения эмбрионального развития и развития личинок.
Выводы
- Данная техника инъекций является базовой для исследований сверчков.
- Она обеспечивает универсальность для различных планов экспериментов.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для проведения более углубленных изысканий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол позволяет осуществлять функциональную манипуляцию генами в нетрадиционных модельных организмах, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах поиска. Обеспечивая гибкую систему фенотипического скрининга различных видов, этот метод повышает прогностическую достоверность при исследовании сигнальных путей и снижает зависимость от допущений, основанных на одной модели. Метод позволяет масштабировать разработку анализов для скрининга соединений и поиска биомаркеров в эволюционно значимых системах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством нокдауна, гиперэкспрессии или редактирования генов в новых модельных системах.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней вне традиционных генетических систем, что снижает видоспецифическую предвзятость.
- Научная ценность: облегчает проведение фенотипического скрининга для оценки значимости мишеней и участия сигнальных путей в эмбриональном развитии.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные на основе флуоресценции для отслеживания экспрессии генов или клеточной динамики in vivo.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированную подготовку эмбрионов насекомых для высокопроизводительного скрининга фармакологических или генетических воздействий.
- Научная ценность: позволяет проводить анализ зависимости «доза-ответ» и временной профилинг введенных реагентов, таких как dsRNA, mRNA или компоненты CRISPR.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Предоставляет систему, релевантную для изучения заболевания, для исследования консервативных путей развития с согласованием трансляционных биомаркеров.
- Практическая ценность: Позволяет проводить межвидовое сравнение функции мишени, улучшая экстраполяцию на системы млекопитающих.
- Научная ценность: Способствует механистическому снижению рисков, выявляя эволюционную консервативность или дивергенцию функций генов до начала инвестиций в исследования на млекопитающих.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод встраивается в рабочие процессы раннего этапа поиска лекарственных средств, позволяя проводить валидацию мишеней и разработку анализа перед идентификацией ведущих соединений и доклинической оценкой.
- Биология открытий: Оказывает поддержку в изучении функций генов и уточнении путей передачи сигналов у видов, которые трудно поддаются генетическому воздействию, но обладают высокой эволюционной информативностью.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные фенотипические результаты, необходимые для подготовки анализа и оценки соединений.
- Аналитика: Позволяет измерять показатели выживаемости, пенетрантность фенотипа и субклеточную локализацию в качестве ключевых аналитических показателей.
- Трансляционные исследования: Связывает фенотипы развития с консервативными путями, поддерживая согласование биомаркеров и продвижение исследований с учетом рисков.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для введения различных реагентов в рамках многочисленных экспериментальных кампаний и классов мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозов, обеспечивая возможность проведения функциональной геномики на недостаточно изученных, но филогенетически значимых организмах.
- Операционная ценность: Предлагает масштабируемую и недорогую систему для получения десятков инъекционных эмбрионов за один эксперимент с выживаемостью до 80% после оптимизации.
- Стратегическая ценность: Снижает риск неудач на поздних этапах за счет раннего выявления проблемных аспектов мишеней посредством межвидового фенотипического скрининга.
- Влияние на портфель: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя понимание механизмов функции мишени на различных эволюционных дистанциях.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области микроинъекций, эмбриологии и микроскопии для точного управления иглой и манипуляций с эмбрионами.
- Зависит от специализированного оборудования, включая скосники, микromanипуляторы, микроинъекторы и микроскопы с возможностью флуоресцентного анализа.
- Необходима стандартизация сбора яиц, подготовки лунок с агарозой и состава буфера для инъекций для всех пользователей и центров.
- Требует учета особенностей адаптации для различных видов насекомых, размеров яиц и стадий развития.
- Включает такие практические ограничения, как засорение иглы частицами желтка, а также зависимость показателей выживаемости от навыков оператора, что требует обучения и практики.
