Выражение, очищение, кристаллизация и ферментные анализы Fumarylacetoacetate Hydrolase Домен-содержащих белков

Наш протокол описывает методы эффективного выражения и очистки домена FAH, содержащего белки, а также белки в целом. Белок FHD-1 играет нормативную роль в цикле TCA и энергетическом метаболизме митохондрий. Мы смогли связать FHD-1 downregulation с клеточной сенесценцией и информация о активности ферментов и структуре белка, как правило, необходимы для того, чтобы понять молекулярные механизмы, стоящие за наблюдаемыми фенотипами.

Основным преимуществом экспрессии белков с помощью неизгладимых векторных систем IPTG является то, что все методы относительно дешевы и просты в установлении в любой лаборатории. С помощью белков полихитидина типа в сочетании с никель NTA агарозы смолы, огромная избирательность сродства хроматографии могут быть использованы по низкой цене. Для большинства целей, белка, полученного в этом качестве, уже может быть достаточно.

FPLC, с другой стороны, является хорошо установленным и общим методом с несколькими преимуществами по сравнению с другими методами. Во-первых, вставьте от 5 до 10 нанограммов плазмиды в 100 микролитров компетентных бактерий BL21-DE3 pLysS E.coli на льду. Слегка коснитесь трубки, чтобы смешать содержимое.

Держите бактерии на льду в течение 30 минут, осторожно нажав трубку каждые несколько минут. Нагрейте термо шейкер до 42 градусов по Цельсию. Поместите трубку, содержащую бактерии, в аппарат и нагрейте в течение 90 секунд.

Затем немедленно поместите трубку на лед. Через 5-10 минут на льду добавьте 600 микролитров среды НЗКИМ и поместите трубку в инкубатор бактерий. Встряхните трубку на средней скорости, ориентированной вдоль направления встряхивания при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.

После инкубации пластина 200 микролитров бактериальной культуры на 10-сантиметровой пластине LB agar, содержащей отбор антибиотиков выбора. Культура бактерий на пластине LB агар в инкубаторе бактерий при 37 градусов по Цельсию в одночасье. После успешного образования колонии, выбрать одну колонию и разогнать его в пять миллилитров N'CYM с выбранными антибиотиками.

Культура в инкубаторе бактерий при 37 градусах по Цельсию за одну ночь. После успешного роста бактерий, усилить бактерии в 250 миллилитров, 500 миллилитров или один литр партий среды в зависимости от спроса на количество белка. Затем, культура бактерий, в инкубаторе бактерий при 37 градусов по Цельсию в течение двух-трех часов.

После инкубации нарисуйте образец для фотометрического анализа. Если оптическая плотность на 600 нанометров достигла 0,4, нанесите 200 микромолей до одного миллимоля изопропил-бета-Д-тиогалактопиранозиданика. После трех-пяти часов в инкубаторе бактерий при 37 градусах цельсия экспрессия белка исчерпана.

Урожай бактериальной гранулы через центрифугу в 5000 раз G в течение пяти минут. Затем отбросьте супернатант и заморозьте гранулы при температуре минус 20 градусов по Цельсию для кратковременного хранения. На каждые 250 миллилитров оригинальной бактериальной суспензии нанесите на бактериальные гранулы пять миллилитров выбранного буфера.

Добавьте 10 микролитров бета-меркаптоэтанола на пять миллилитров прикладного буфера. Используйте 10 миллилитров трубы Пастера, чтобы механически заставить гранулы в подвеску, царапая и трубы. Перенесите всю подвеску в 50-миллилитровую трубку.

Затем sonicate подвески. Далее центрифуга в течение 30 минут на высокой скорости при четырех градусах по Цельсию. Фильтр супернатант последовательно с фильтром единиц на льду.

Подготовьте пустую пластиковую или стеклянную колонку, прикрепив ее к стабильному фиксатору и стирая буфером никеля NTA. На каждые 10 миллилитров белковой суспензии нанесите на колонну 500 микролитров навоза никеля NTA agarose. Заполните столбец полностью с никеля NTA работает буфер обеспечения не нарушать смолы агарозы и позволить буферу пробежать под действием силы тяжести.

Затем нанесите белковую подвеску на колонку и позвольте образцу пробежаться под действием силы тяжести. После того, как образец прошел, заполните столбец буфером никеля NTA. Поместите уф-прозрачный кювет под колонку и соберите один миллилитр буфера никеля NTA elution.

Проверьте оптическую плотность образца на 280 нанометров по сравнению с пустым образцом. Оптимально, образец отображает оптическую плотность больше, чем 2,5. Так как белки FAHD и буфер никеля NTA elution осаждаются при замораживании и оттаивании, диализ белка против другого буфера ночь на льду, используя один микролитр DTT на 100 миллилитров буфера диализа.

Настройка системы FPLC и мыть колонку с пятью объемами столбца 20%этанола следуют пять объемов колонки воды. После равновесия столбца нанесите на столбец обезвемый образец и соберите поток. Настройка градиентной элюции.

После завершения градиента запустите с высоким буфером соли до тех пор, пока не будет обнаружено больше пиков в диапазоне одного объема столбца. Запустите считыватель микро-пластин и equilibrate в течение 30 минут при 25 градусов по Цельсию. Подготовьте один миллилитр 20-миллиметрового раствора субстрата для тестирования в буфере анализа ферментов.

Согласно схеме пипетки в текстовом протоколе, подготовить фермент пустой и образец скважин путем пипетки 90 микролитров фермента анализа буфера в скважины с пятью микролитров ферментного раствора. Затем подготовьте подложку и пробные скважины, засовав в скважины 95 микролитров буфера анализа ферментов. Прямо перед измерением нанесите пять микролитров буфера анализа ферментов на шесть пустых скважин.

Нанесите на выборочные скважины пять микролитров 20-миллиметрового подстрата. Используйте многоканарный пипетки при установке 50 микролитров, чтобы аккуратно перемешать скважины. Затем вставьте пластину в считыватель микро-пластин и измерьте каждый хорошо на 255 нанометров.

Наконец, выполните анализ в электронной таблице. Здесь показаны два примера пластин LB agar после оптимальной и неоптимальных преобразований. Слишком много бактериальных колоний указывают либо на то, что две многие бактерии были помыты или что антибиотики могут быть просрочены.

Слишком мало бактериальных колоний может свидетельствовать о том, что либо недостаточно плазмид был использован для преобразования или что слишком много антибиотиков были использованы для выбора бактерий. Бактериальная гранула, содержащая выраженный белок в миллиграммовых количествах, собирается и экспрессия проверяется через SDS-страницу. Некоторые проблемы могут возникнуть во время этого в противном случае простой процесс, в том числе белки формирования включения органов или белка не выражается.

Если его-тег используется для тега белка, сродство хроматографии с никеля NTA агароза является простым и дешевым методом захвата устранения большинства загрязнений. Если тег не используется, сочетание сульфатных осадков аммония и последовательной гидрофобной хроматографии обмена может также отделить белок от большинства других белков. Белок далее отделяется от остатков загрязнений хроматографией ионого обмена, за которой следует хроматография исключения размера для получения достаточно чистого белка.

Ни один из описанных методов не является сложным, в частности. Но все методы требуют обучения. Первые попытки могут провалиться, но эксперименты увенчаются успехом после некоторых дополнительных адаптаций.

Все представленные здесь методы являются общими методами очищения белка. Хотя протокол специализируется на белках FAHD, он может быть адаптирован к любому белку, который хотелось бы очистить. Рекомбинантный человек FAHD-1 был получен с помощью описанных методов и высокого разрешения рентгеновских структур способствовали массово наше понимание FAHD-1 по функциональности, действуя как, декарбоксилазы и гидролазы.

Бактерии, используемые в этой работе являются штаммами безопасности и не опасны. Общие руководства по безопасности применяются ко всем химическим веществам, и колонны FPLC должны быть обработаны с осторожностью.