Митохондрии и эндоплазмические ретикулами imaging коррелятийным светом и объемной электронной микроскопией
20 июля 2019 г.
Мы представляем протокол для изучения распределения митохондрий и эндоплазмической ретикулум в целых клетках после генетической модификации с использованием корреляционного света и объема электронной микроскопии, включая аскорбат омоксидазы 2 и преносида хрена окисления, серийное сечение клеток с геном-мишенью и без нее в том же разделе, а также серийное изображение с помощью электронной микроскопии.
Этот метод электронной микроскопии объема используется для выполнения биологических исследований, которые требуют наблюдения 3-D структуры. Предлагая стержень, fielder зрения, и образец хранения до изображения пересдачи. Fx2 Asan спроектировал этапы пути, которые катализировали деабилацию для увеличения электронного испытания целевых структур и могут быть использованы для определения конкретной цели, представляющие интерес.
Эти частицы сочетают в себе использование метода коррелативного света и 3-D электронной микроскопии для исследования взаимодействий между membranous organelles и клетками-хозяинами. Через 16-24 часа после трансфекции аккуратно промыте культуру 250 микролитров раствором фиксации 30-37 градусов по Цельсию. Быстро заменить стирку 1,5 миллилитров свежего раствора фиксации, и размещение культуры на льду в течение 30 минут.
В конце инкубации, промыть клетки с тремя десять минут моет в один миллилитр ледяной 0,1 молярного буфера какодилата натрия на стирку. После последней стирки добавьте один миллилитр ледяного 0 до 4 градусов по Цельсию 20 миллимолярный раствор глицина в блюдо для десятиминутной инкубации на льду, а затем три пять минут моет с одним миллилитром свежего, холодного 0,1 молярного буфера какодилата натрия за стирку. Затем наклеить на клетки 500 микролитров свежеприготовленного раствора DAB.
И инкубировать клетки на льду в течение примерно пяти-сорока пяти минут. Когда светло-коричневое пятно видно под перевернутым световым микроскопом, промыть клетки три раза с одним миллилитр свежего, холодного 0,1 молярного буфера какодилата натрия в течение десяти минут за стирку. Затем используйте перевернутый инвертированный микроскоп фазового контраста, чтобы визуализировать окрашивание DAB при 100-м увеличении или выше и пометить дно стекла, где находится область интереса.
Для подготовки образца блока электронного микроскопа, сперва post-fix клетки с одним миллилитром 2%уменьшенного тетроксида осмия на один час на 4 градусах Celsius. В конце фиксации, промыть клетки с тремя пятиминутные моет и один миллилитр свежей дистиллированной воды на стирку. Перед лечением клеток одним миллилитром фильтрованного раствора TCH в течение 20 минут.
В конце инкубации, мыть клетки три раза в дистиллированной воде, как только что продемонстрировали и исправить клетки с 30-минутной инкубации в 2%снижение тетроксида осмия. В конце второй фиксации, мыть клетки три раза дистиллированной водой и покрыть культуру с одним миллилитр aqueous 1%уранил ацетат ночь при 4 градусах цельсия защищены от света. На следующее утро, мыть клетки три раза с дистиллированной водой, прежде чем окрашивание с одним миллилитр 60 градусов по Цельсию нагревается Уолтон свинца аспартатный раствор в течение 30 минут в духовке 60 градусов по Цельсию.
В конце инкубации, мыть клетки три раза в дистиллированной воде. И инкубировать культуру в градуированных серии 20-минутный 2 миллилитров этанола aliquots. После последнего 100%-ного воздействия этанола, инкубировать клетки в течение 30 минут в один миллилитр из трех до одного этанола с низкой вязкостью встраивания смеси среды при комнатной температуре.
В конце инкубации замените среду одним миллилитром этанола один к одному до низкой вязкости, встраивая смесь среды еще на 30 минут инкубации при комнатной температуре. Затем замените средний с одним миллилтером от одного до трех этанола на низкой вязкости встраивания смеси среды в течение дополнительных 30 минут при комнатной температуре. Затем замените среду одним миллилитром 100%-низкой вязкости, встраивая среду на ночь, а затем встраивая образец в 100%low viscosity встраивая смесь в течение 24 часов при 60 градусах Цельсия.
Для анализа электронной микроскопии передачи, на следующий день, используйте ультра микротом для получения 90 нанометров толщиной разделов и наблюдать сетки под передачей электронной микроскопии на 200 киловольт. Перед началом подготовки образца, чистый оксид олова indium покрытые стеклянные крышки с нежным возбуждением в изопропанол в течение 30 до 60 секунд. В конце агитации слейте лишний алкоголь и поместите крышки в безпыслятую среду.
Когда крышки сухие, используйте плазменный вешалка, чтобы светиться разряда coverslips в течение одной минуты. Затем вставьте крышки в держатель субстрата и поместите держатель субстрата в нож лодки. Чтобы получить образцы для сканирования электронной микроскопии, вставьте встроенный блок образца в образец держателя ультрамикротома.
И установите держатель в блок обрезки. Используйте лезвие бритвы, чтобы обрезать избыток смолы вокруг целевого положения, так что лицо блока приобретает трапециевидную или прямоугольную форму. Ведущие и задние края должны быть строго параллельны друг другу.
Нелегко приобрести большое количество серийных секций. Тем не менее, вы должны иметь ведущие края и задние края полностью параллельно. Затем вставьте держатель образца в руку ультрамикротома.
Поместите алмазный нож в держатель ножа, и заполнить нож лодку с фильтрованной дистиллированной водой. Затем осторожно нажмите на ручку держателя, чтобы настроить положение носителя так, чтобы край крышки был близок к ножу. После получения образца, остановить процесс секционирования, медленно открыть зажим винт трубки и слить воду лодки.
Когда процесс сбора лент будет завершен, удалите субстрат с помощью ручки зажима устройства и высушите ленту. Использование генетически помеченных плазмидов, выражаюющих интерес белков, позволяет идентифицировать трансфицированные клетки-мишени после окрашивания для помеченных белков. Коррелятивная световая электронная микроскопия может быть использована для дальнейшей визуализации обозначенной клеточной культуры.
Например, темное пятно, генерируемое SCO1-APEX2, наблюдается исключительно в митохондриальном пространстве, а не в матричном пространстве митохондрий. Код трансфицированных клеток с обеих SCO1-APEX2 и HRP-KDEL плазмиды выражают очень плотный электронный сигнал в митохондриальном пространстве интермембрана и эндоплазмической цитикулум. Тем не менее, эндоплазмическое окрашивание стикулум не наблюдается в клетках, которые трансфицированы только SCO1-APEX2.
Для серийной визуализации путем сканирования электронной микроскопии создается обзор всего массива изображения с помощью детектора электронов backscatter на большой площади. Далее, область интереса помещается в первом разделе и распространяется на все другие разделы. Наконец, область интереса, содержащая пять целевых ячеек, изображена с пятью нанометровых пикселей.
Увеличение показывает подробные субклеточные структуры, такие как аппарат Голги, митохондрии и эндполасмная ритикулум. Серийная визуализация ясно показывает, что эндоплазмические контакты ритулум-митохондрий происходят на разных z-самолетах. Вы должны иметь хорошее понимание того, как найти конкретную целевую структуру с помощью коррелятивного света и электронной микроскопии для исследования последствий конкретной модификации идентичности.
Эти методы окрашивания в сочетании с объемом электронной микроскопии могут быть использованы для более масштабного EM для исследования клеточных взаимодействий, особенно в евровирусе. Помните, глутаралдегид, а также энтетероцид и TCH очень токсичны, так что не забудьте носить защитную одежду и работать в дым капот при использовании этих материалов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол изучения распределения митохондрий и эндоплазматического ретикулума в целых клетках после генетической модификации. Для анализа клеточных структур используются методы корреляционной световой и объемной электронной микроскопии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Нейробиология
- Методы микроскопии
Теоретические основы
- Митохондрии и эндоплазматический ретикулум являются важнейшими органеллами, обеспечивающими функционирование клетки.
- Понимание особенностей их распределения позволяет получить представление о клеточных процессах.
- Корреляционная микроскопия обеспечивает возможность детального структурного анализа.
- Генетические модификации могут изменять распределение и функции органелл.
Цель исследования
- Изучить пространственное распределение органелл после генетической модификации.
- Использовать передовые методы визуализации для улучшения качества изображений.
- Сравнить влияние генетических модификаций на позиционирование органелл.
Используемые методы
- Корреляционная световая микроскопия для первичной визуализации.
- Объемная электронная микроскопия для детального структурного анализа.
- Методы окрашивания на аскорбатныйпероксидазу 2 и пероксидазу хрена.
- Серийное срезание клеток для получения исчерпывающих данных.
Основные результаты
- Детальное картирование распределения митохондрий и эндоплазматического ретикулума.
- Выявление различий в расположении органелл между модифицированными и немодифицированными клетками.
- Изучение взаимодействий между органеллами и клеточными структурами.
- Валидация методов визуализации для последующих исследований.
Выводы
- Данный протокол эффективно выявляет изменения в распределении органелл, вызванные генетическими модификациями.
- Корреляционная микроскопия представляет собой мощный инструмент для клеточного анализа.
- Полученные результаты расширяют понимание динамики органелл в клетках.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Корреляционная световая и объемная электронная микроскопия обеспечивает трехмерную визуализацию сетей мембранных органелл с высоким разрешением, восполняя критический пробел в структурной биологии при валидации мишеней. Данный подход способствует снижению механистических рисков, выявляя субклеточные взаимодействия, которые влияют на локализацию белков и функцию органелл, что является ключевым аспектом на ранних этапах поиска лекарственных средств. Этот метод повышает прогностическую достоверность фенотипического скрининга, обеспечивая наноразмерный контекст для генетических или фармакологических воздействий.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать сайты контактов между митохондриями и ЭР как функциональные узлы в путях клеточного стресса и сигналинга.
- Практическая ценность: обеспечивает прямую визуализацию морфологии органелл и их пространственных взаимоотношений после генетического или химического воздействия.
- Прогностическая ценность: способствует снижению рисков при выборе мишеней путем подтверждения ожидаемой субклеточной локализации меченых белков, таких как SCO1-APEX2, в межмембранном пространстве.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные данные об ультраструктуре в 3D, которые могут служить эталоном воспроизводимости анализа при проведении скринингов, ориентированных на органеллы.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизацию процессов подготовки образцов и визуализации, совместимых с массивной томографией и серийным срезанием.
- Готовность анализа: Облегчает корреляцию между сигналами световой микроскопии и паттернами электронно-плотного окрашивания для верификации мишени.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает генетические модификации с измеримыми изменениями архитектуры органелл, что способствует переходу от анализа фенотипа к выявлению механизмов.
- Снижение механистических рисков: позволяет визуализировать контакты между ЭР и митохондриями в различных z-плоскостях, что дает данные для моделей кальциевой сигнализации и переноса липидов, значимых для моделей заболеваний.
- Релевантность для доклинических моделей: применимо к системам, соответствующим патологии заболеваний, в которых динамика органелл вносит вклад в патофизиологические механизмы.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочий процесс поиска новых лекарственных средств — от ранней валидации мишени до последующего изучения механизмов действия, обеспечивая структурный контекст, который дополняет функциональные анализы и служит основой для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки на базе фенотипической достоверности.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез путем визуализации того, приводят ли генетические модификации к ожидаемым изменениям в архитектуре органелл и межорганеллярных контактах.
- Скрининг: позволяет получать воспроизводимые структурные данные с высоким содержанием информации для валидации результатов в фенотипических скринингах, ориентированных на органеллы.
- Аналитика: предоставляет количественные 3D-измерения морфологии органелл, частоты контактов и пространственного распределения для сравнительного анализа в различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает молекулярные пертурбации со структурными результатами, помогая интерпретировать активность биомаркеров или сигнальных путей в моделях заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает стандартизированную масштабируемую платформу для ультраструктурного анализа, которая может быть применена в нескольких проектах и для различных классов мишеней.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени за счет снижения неопределенности в данных о субклеточной локализации и взаимодействии органелл.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимую 3D-визуализацию с наноразмерным разрешением благодаря стандартизированным протоколам фиксации, окрашивания и секционирования.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений при идентификации ведущих соединений, предоставляя данные о механизмах влияния соединений или генетических факторов на архитектуру клетки.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков, подтверждая, соответствуют ли наблюдаемые фенотипы ожидаемым структурным изменениям в системах, релевантных для данного заболевания.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области корреляционной микроскопии, подготовки образцов для электронной микроскопии и стратегий генетического мечения.
- Необходимо наличие оборудования для объемной электронной микроскопии, ультрамикротомов и таких реагентов для окрашивания, как DAB, тетраоксид осмия и ацетат уранила.
- Требуется межкомандная стандартизация между подразделениями микроскопии, молекулярной биологии и гистологии для обеспечения единообразия при подготовке образцов и интерпретации данных.
- При применении протокола к различным типам клеток или условиям фиксации необходимо учитывать необходимость адаптации, особенно в отношении проницаемости и эффективности окрашивания.
- Ограничено технической сложностью и временем, необходимым для серийного срезания и выравнивания изображений, что может снизить пропускную способность при крупномасштабном скрининге.
