Электрофизиологические записи одноклеточных ионных токов под четко определенным сдвигами

Цель юга этого протокола состоит в том, чтобы описать модифицированную камеру потока параллельных пластин для использования в исследовании активации в реальном времени механочувствительных ионных каналов сдвигами.

Использование модифицированной параллельной камеры потока пластин может помочь исследователям ответить на ключевые вопросы, относящиеся к функциональной реакции механочувствительных ионных каналов на стресс стрижки. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет в режиме реального времени исследования потока активированных ионных каналов в легко собранной, многоразовой параллельной камеры потока пластины. Чтобы начать процедуру, нанесите тонкий слой силиконового еластомного раствора по краям прямоугольного пространства части С и аккуратно поместите прямоугольное стекло крышки, кусок D, прямо на раствор еластомера, чтобы полностью покрыть открытое прямоугольное пространство куска C.Carefully стереть излишки силиконового еластомного раствора.

Затем повторите процедуру прилипния прямоугольного стекла крышки, кусок F, к нижней части E и позвольте силиконовой еластомер решение вылечить на ночь при комнатной температуре. Теперь, собрать MPP поток камеры последовательно размещения каждого куска на вершине предыдущего, начиная с нижней камеры, кусок E, а затем кусок C, кусок B, а затем кусок А на вершине. Далее, выровнять винт отверстия каждого куска по углам и плотно винт куски вместе, чтобы предотвратить утечки происходят при администрировании потока в камеру потока MPP.

В шесть-хорошо пластины, место от четырех до пяти, 12 миллиметров покрытия стеклянные круги в каждом хорошо. Сохранить клетки между 10%и 30% слияния, так что одиночные клетки могут быть доступны для электрофизиологических записей. Впоследствии инкубировать клетки в стандартных условиях культуры в течение не менее двух часов, чтобы клетки придерживаться, и не более 24 часов, как эндотелиальные клетки станут плоскими и трудно патч, когда посеяны в субвлияние в течение более 24 часов.

Затем снимите стекло крышки, содержащее прилипаемые клетки, из колодец из шести хорошо пластины и быстро промыть в PBS. Затем перенесите крышку стекла с клетками на 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую два миллилитров электрофизиологического раствора BAF. Немедленно перенесите крышку стекла с ячейками в камеру потока MPP.

Перенесите круг крышки стекла на прямоугольное стекло крышки, кусок D, который придерживается части C камеры потока MPP. Добавьте раствор BAF, чтобы полностью погрузить круг крышки стекла и клетки. Впоследствии, положение крышки стеклянный круг на кусок D так, что клетки будут в соответствии с щели отверстия части B.Убедитесь, что крышка стеклянный круг придерживается кусок D через решение стеклянной адгезии, чтобы избежать нарушения положения крышки стекла круг потока приложения.

Затем соберите камеру потока MPP, завинчивая части вместе в соответствующем порядке. Перенесите камеру на стадию микроскопа и немедленно пронизать камеру раствором BAF. Затем определите здоровую клетку с темной границей и очевидным ядром для эксперимента.

Избегайте клеток, которые, как представляется, blubbing или клетки, которые находятся в контакте с другими клетками. Чтобы контролировать стресс от стрижки, создать систему гравитации перфузии, подключив 30 миллилитров закончил шприц цилиндр в трехмерный замок Luer оснащен микробортных труб. Затем прикрепите градуированный цилиндр к клетке Фарадея, окружающей электрофизиологическую установку, используя двустороннюю ленту.

Перед вставкой трубки в камеру MPP предварительно заполните шприц и трубки раствором BAF. Затем вставьте трубки в отверстие камеры потока MPP части A.Pre-заполнить камеру потока MPP с раствором, таким образом, что он удаляется в вакуумном резервуаре. Остановите поток в камеру и пополнить градуированный цилиндр до верхней отметки.

Рассчитайте скорость потока вручную с помощью секундомера, позволяя раствору протекать через камеру на данной высоте цилиндра шприца. Поднимите или опустите шприц, чтобы изменить поток и рассчитать стресс стрижки в параллельной камере, используя это уравнение. Повторите этот процесс до тех пор, пока не будет обнаружен желаемый уровень стресса, связанный с стрижкой.

Впоследствии перенесите собранную камеру, содержащую прилипаемые клетки, на микроскопную стадию электрофизиологической установки. И вставьте трубки, предварительно заполненные раствором BAF, в отверстие кусок A.Then, заполнить камеру и мыть клетки с 10 миллилитров раствора BAF, одновременно. После того, как желаемая конфигурация патча будет успешно получена, позвольте течением канала стабилизироваться в статической ванне при комнатной температуре.

Как только течения стабилизировались, применять стрижку в шаг-мудрый моды, что позволяет увеличение тока стабилизировать до следующего шага увеличения стресса стрижки. Удалите воздействие сдвига на клетки, остановив поток в камеру, позволяя механочувствительным течениям каналов вернуться к базовым течениям, наблюдаемым в статической ванне. Здесь показана репрезентативная необработанную запись кирового тока из первичной мезентерической эндотелиальной клетки мыши с заметным линейным внешним током утечки.

Пандус отрицательных 140 до положительных 40 милливольт был применен к патчу более 400 миллисекунд. Ток утечки предотвращает анализ реальной активности канала Kir. Чтобы вычесть ток утечки, сначала вычислите линейную проводимость наклона тока утечки.

Множественный наклон G соответствующими напряжениями всего необработавого следа для построения тока утечки на необработанных данных. Линия должна наложить наружную линейную утечку точно. Затем вычесть построенный ток утечки из всего следа так, что линейный внешний ток составляет около нуля пикоамперов на пикофарад, и реальный ток Кира может быть проанализирован.

Самое главное помнить при попытке этой процедуры, чтобы правильно распоставить крышку стекла в камеру, так что клетки доступны для экспериментов. Кроме того, убедитесь, что крышка скольжения адекватно придерживается кусок D, так что поток жидкости не нарушает крышку стекла, содержащего клетки.