Обнаружение внесосудистой трипаносомой паразитов путем тонкого аспирации иглы

Тонкая цитология аспирации игл является недорогим, простым, быстрым и минимально инвазивным методом, который мы используем для сбора трипаносом от ощутимых поражений в органах у живых мышей. Учитывая, что тонкая аспирации иглы является не терминальной процедурой, она позволяет повторного отбора проб в том же животном с течением времени. Если эти выводы могут быть переведены на крупный рогатый скот, этот метод будет очень полезен для ветеринаров для диагностики трипаносомоза у крупного рогатого скота на ферме.

Демонстрацией процедуры окрашивания мазка будет Ана Маргарита Сантос, помощник технолога из моей лаборатории. Для начала подтвердите анестезию методом щепотки нос. Когда рефлекс опрокидывания ноги отсутствует, положение мыши в спинной лежачих.

Тщательно пальпировать яички, чтобы определить размер и расстояние от чрезмерной кожи, а затем ограничить его между указательным и средним пальцем или между указательным пальцем и большим пальцем. Для дальнейшей обездвиживания цели, растянуть чрезмерной кожи плотно и очистить поверхность с спиртом салфетки. Затем вставьте кончик иглы иглы 23 калибра, подключенной к пятими миллилитровому шприцу, в цель, убедившись, что поршень находится в состоянии покоя.

Чтобы применить всасывание, втягивать поршень шприца до трех-четырех миллиметров знак два-три раза. Чтобы увеличить вероятность получения репрезентативной выборки и ориентации небольших структур, таких как эпидидимис, перенаправьте иглу внутри органа либо по прямой линии, либо по нескольким различным касательной. Отпустите всасывание, а затем снять иглу.

Игла может быть удалена только после того, как отрицательное давление будет выпущено, отпустив поршень. В противном случае, аспират всасывается в шприц и невосполним. Нанесите давление стерильной марлевой губкой на месте прокола, чтобы контролировать кровотечение.

Отсоедини шприц от иглы и наполните его воздухом. Воссоедините иглу, поместите кончик иглы очень близко или даже на слайде и аккуратно выбросьте содержимое иглы на слайд. Для обеспечения взятия проб выполнить по крайней мере одно дополнительное стремление на орган и животное.

После возвращения анестезии с подкожной инъекцией 200 микролитров по 1 миллиграмму на килограмм атипамизола в солевой раствор, возвращай животных в свою домашнюю клетку для выздоровления. Используя недоминантную руку, возьмите слайд, который имеет каплю аспирата щипать матовой конец между большим и указательным пальцами. Используя доминирующую руку, возьмите чистый слайд распределитель и поместите его гладким чистым краем через второй слайд только на верхней части падения под углом около 30 градусов.

Чтобы получить тонкую пленку, скользить слайд вперед с одним светом непрерывного и устойчивого движения. Отдых слайд и обеспечить полную и быструю сушку воздуха материала. Наклеьте карандашом матовую кромку слайда.

Для протокола окрашивания Giemsa, исправить воздух сушеные мазки, погружая слайды в банку Coplin, содержащий 100% метанол в течение пяти минут. Затем перенесите слайды в банку Coplin, содержащую 20%Giemsa раствор и дистиллированной воды в течение 30 минут. Промыть слайды в водопроводной воде и мазок салфеткой, чтобы высохнуть тщательно.

Удерживая слайд горизонтально, нанесите на мазок несколько капель неакеозной крепления среды. Поместите край крышки стекла на слайд, опустите его и нажмите осторожно, чтобы удалить любые пузырьки воздуха. Для иммуноцитохимии, исправить воздух сушеные мазки в 100% метанола при комнатной температуре в течение 10 минут.

Вымойте слайд в течение пяти минут в банке Coplin с 1X PBS повторяя этот шаг три раза, используя свежие 1X PBS каждый раз. После удаления слайдов из банки Coplin, протрите избыточный буфер, не касаясь мазка и провести линию вокруг мазка с водоотталкивающей ручкой. Удерживая слайд горизонтально, нанесите 150 микролитров разбавленного раствора первичного антитела на каждый мазок и инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре.

После инкубации, мыть слайды в течение пяти минут в банке Coplin с 1X PBS повторяя этот шаг три раза с помощью свежих 1X PBS каждый раз. Удерживая слайд горизонтально, нанесите 150 микролитров коммерчески доступной системы визуализации хрена peroxidase DAB на каждый мазок, а затем инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. Вымойте слайды снова три раза в течение пяти минут в PBS.

Затем counterstain, погружая слайды в банку Коплин, содержащий Харрис гематоксилин в течение 10 секунд. Промыть в водопроводной воде и мазок бумагой, чтобы высохнуть тщательно. Удерживая слайд горизонтально, нанесите на мазок несколько капель неакеозной крепления среды.

Поместите край крышки стекла на слайд, опустите его и нажмите осторожно, чтобы удалить любые пузырьки воздуха. Мазок хорошего качества характеризовался монослой клеток с хорошей плотностью и сохранившимися морфологическими особенностями, позволяющими идентифицировать их ткани происхождения и относительную пропорцию друг между другом. Кроме того, паразиты были эффективно иммунотестных, идентифицируемых и подсчитываемых.

Плохие или отрицательные тонкие результаты устремления иглы могут быть из-за слишком маленького материала и таким образом под представителем массы или органа. Это также может быть связано с слишком большим материалом на одном слайде решений слишком толстые мазки и нарушения цитологической оценки. Так называемый дробленый артефакт происходит из-за слишком большой силы, применяемой при принятии мазка оставляя нарушенных клеток в результате чего много голых ядер и полос ДНК.

Когда не хватает силы применяется во время подготовки мазка, клетки не дезагрегируется в результате стратифицированного слоя, который препятствует оценке морфологических особенностей клеток. Сравнение тонкой цитопатологии аспирации иглы с гистопатологией, цитопатологией имело преимущество лучше сохранившейся клеточной морфологии и лучшей оценки относительных пропорций и подсчета клеток. Иммуноцитохимия проще, быстрее и проще в оптимизации, чем иммуногистохимия.

Для тонкой аспирации иглы, всегда обеспечить хорошую иммобилизацию животного, стабилизация органов или массы, чтобы быть аспирированным, и скоординированное применение вакуума и выпуска. Затем для высококачественных мазков, сразу же распространение после того, как материал был помещен на стекло и быть нежным на прочность применяется, чтобы сделать мазок, чтобы избежать ячейки измельченных артефактов. В дополнение к обычной микроскопии и иммуноцитохимии, этот материал также может быть использован для электронной микроскопии, биохимического анализа, цитометрии потока, молекулярной биологии, или даже для анализа in vitro.

Этот метод позволил нам продемонстрировать, что тонкая аспирации иглы могут быть использованы для диагностики и изучения заболеваний у экспериментальных животных. Мы смогли диагностировать тропизм паразитов трипаносомы внешним мужским репродуктивным органам, а также охарактеризовать это заболевание в течение инфекции.