Характеристика на молекулярном уровне с использованием надежных биохимических подходов нового белка киназы

Иммунопреципиентация является очень мощным методом изоляции и очистки целевого белка. В гладких условиях, белки, регуляторы, или субстраты могут быть со-иммунопрецилитированы. Затем может быть обнаружена новая сеть взаимодействия.

Также может быть оценена активность иммунопреципиатного белка. В частности, активность киназы может быть проверена на различных субстратах с помощью маркировки P32-ATP. Тем не менее, активность ингибиторов, нацеленных на киназу, участвуют в болезни могут быть оценены.

Они могут представлять собой свинца соединений для разработки новых препаратов. Этот метод может быть расширен от млекопитающих до дрожжей или бактерий. Этот метод не так сложно.

Для ключевых моментов: убедитесь, что негативный контроль, чтобы убедиться, что обнаруженное взаимодействие является специфическим, и тщательно выбрать условия лиза, чтобы сохранить взаимодействия и активность. Небольшие детали и жесты важны для обеспечения успеха этой техники, и они никогда не описаны в материалах и методах статей. Демонстрацией процедуры будет Фабьен Годин, техник из нашей лаборатории.

После того, как клетки подготовлены в комнате культуры клеток в шкафу биобезопасности, используйте 10 миллилитров пипетку, чтобы удалить средства массовой информации из пластин и выбросить его в выделенную бутылку отходов с отбеливателем. Затем добавьте 10 миллилитров свежей дополненной DMEM и положите пластины обратно в инкубатор при 37 градусах цельсия. Чтобы подготовить трансфекцию смеси, в 15 миллилитров трубки, добавить 450 микролитров 10 миллимолярный раствор гидрохлорида Tris при рН 7.5, дополненный одним миллимолярной ЭДТА и 50 микролитров 2,5 мларного раствора хлорида кальция.

Смешайте с инверсией. В трубку добавьте объем, соответствующий 10 микрограммам плазменной ДНК, усиленный набором ДНК-мидипропа и разбавленный буфером элюционирования этого комплекта, и концентрация которого была определена. Переверните трубку, чтобы смешать.

Затем, с плавным возбуждением на вихревом миксере, медленно добавляйте 500 микролитров буферного солевого 2X концентрата BES, капля за каплей в трубку. Перемести его очень осторожно, чтобы не нарушить сложное образование между ДНК и фосфатом кальция. Инкубация в течение не менее 15 минут, или до 45 минут, при комнатной температуре.

Теперь перенесите пластину в трансфект из инкубатора в шкаф безопасности. Добавьте подготовленные комплексы ДНК капля за каплей на клетки по всей поверхности пластины. Инкубировать в течение 24 до 72 часов в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию.

Для предотвращения деградации белка подготовьте буфер лиза на льду с учетом четырех миллилитров буфера лиза для каждой трансфицированной пластины. Возьмите тарелку с трансфицированными клетками из инкубатора. Удалите средства массовой информации и выбросить его в специальную бутылку отбеливателя отходов.

Чтобы вымыть клетки, добавьте три миллилитров холодного PBS на стороне пластины капля за каплей, чтобы избежать отсоединения трансфицированных клеток. И осторожно вихрем пластины для распространения буфера по всей поверхности. Наклоните пластину, чтобы удалить PBS и выбросить его в бутылку отходов.

Повторите стирку еще раз. Поместите тарелку на лед. В конце, тщательно удалите остальную часть PBS.

Затем добавьте 500 микролитров холодного буфера лиза в трансфицированные промытые клетки. Распространение его по всей поверхности пластины. Инкубировать в течение 10 минут на льду.

Время от времени, снова распространение буфера по всей поверхности пластины. После этого используйте клеточный шпатель, чтобы соскребать клетки с поверхности и собирать их в трубку микроцентрифуга. Центрифуга в течение 10 минут при 10 000 раз G и четыре градуса Цельсия.

Соберите супернатантный лизат в новую трубку микроцентрифуга и соберите 50 микролитров алицитов этой фракции в другую новую микроцентрифугную трубку. Этот aliquot будет использоваться, чтобы проверить, если трансфицированные белки хорошо выражены. Выбросьте гранулы в мусорное ведро.

Во-первых, аккуратно повторно посовестить фондовый раствор агарозных бусин в сочетании с соответствующим антителом. Вырезать конец 200 микролитер отзыв, чтобы сделать один-два миллиметра открытия. Прикрепите наконечник к микропипету и нарисуйте 40 микролитров раствора, позволяя бисеру войти в кончик.

Pipette бисер вверх и вниз несколько раз, чтобы насытить кончик, чтобы обеспечить правильный объем бисера и передачи бисера в трубку микроцентрифуг. Добавьте 500 микролитров буфера TNET, смешайте с помощью инверсии и центрифуги в течение двух минут при 1000 раз G и четыре градуса по Цельсию. Аккуратно удалите супернатант и добавьте 500 микролитров буфера TNET.

Инкубировать на вращающемся колесе, по крайней мере один час при четырех градусах по Цельсию. Затем центрифуга трубки в течение двух минут в 1000 раз G и четыре градуса по Цельсию и мыть бисер дважды с 500 микролитров лиза буфера путем инвертирования и центрифугирования. После мытья перенесите ранее собранную общую фракцию лисировать в трубку и инкубировать на вращающемся колесе при четырех градусах по Цельсию в течение двух-четырех часов.

Теперь центрифуга трубки, содержащей иммунопреципиатированные бусы в течение двух минут при 1000 раз G и четыре градуса по Цельсию. Вымойте бисер пять раз с 500 микролитров буфера лиза путем инвертирования и центрифугирования. При мытье бисера, позаботьтесь, чтобы не подйти слишком близко от бисера при удалении supernatant.

В противном случае, бисер будет аспирирован и в конце эксперимента, больше не будут оставлены бусы. Для elution, первая центрифуга в течение двух минут при 1000 раз G и четыре градуса по Цельсию. Используйте один миллилитровый микропипют, чтобы тщательно удалить супернатант.

Затем, с помощью шприца Гамильтона, оснащенного зацементированной иглой, удалите последние капли супернатанта, чтобы избежать аспирации бисера. Далее добавьте 40 микролитров буфера 4X Laemmli. Гомогенизировать, осторожно нажав трубку.

Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем центрифуга в течение пяти минут при температуре 10 000 Г и комнатной температуре. С помощью шприца Гамильтона перенесите супернатант eluate в новую микроцентрифугную трубку.

Хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Клетки HEK-293 были трансфицированы нетеговой LIMK 2-1 или одной из отмеченных HA изоформ LIMK 2. LIMK 2-1 хорошо выражен в различных условиях.

Антитела LIMK 2-1 не распознают LIMK 2a и LIMK 2b isoforms, и это специфично, так как его сигнал уменьшается, когда клетки трансфицированы с LIMK2 небольшой мешаемой РНК, по сравнению с контролем небольшой интерстрагированной РНК. В различных линиях клеток человека, LIMK 2-1, как представляется, выражается в HEK-293 и HeLa, но не в C6. Эксперименты coimmunoprecipitation были использованы для оценки взаимодействия LIMK2-1 с восходящей киназы ROCK. Каждый из различных белков, кодируемых трансфицированными переносчиками, был хорошо выражен.

Три изоформа LIMK2, а также larp6, были эффективно иммунопрециалитированы. В элуатах, ROCK был обнаружен и, таким образом, coimmunoprecipitated с тремя изоформами LIMK2, но не с larp6. Обнаруженное взаимодействие затем специфичен.

Coimmunoprecipitated LIMK 2-1 был протестирован на активность киназы с помощью гамма-P32 АТФ маркировки. LIMK 2-1 не фосфорилат кофилин, в то время как он фосфорилат миелин основной белок, или MBP. LIMK 2-1 эффективно иммунопрециалитирован в этом тесте.

Очень важно иметь отрицательный контроль при выполнении иммунопреципиентации, чтобы убедиться, что взаимодействие является специфическим. Для сохранения взаимодействия и активности необходимо тщательно настроить состав буфера лиза. При иммунопреципиентации активность киназы может оцениваться с подсчетом различных субстратов.

Мутация может быть легко введена и может разгадать роль конкретных остатков. Функциональные исследования также могут быть выполнены, чтобы понять физиологическую роль новых выделенных взаимодействий. Клетки должны быть выуплены в специальной комнате культуры в шкафу биобезопасности.

P32 ATP должен быть обработан с особой осторожностью. защита от радиации, счетчик Гейгера, сбор конкретных отходов, личные значки груди и пальцев для обнаружения радиоактивного воздействия и фильтр советы.