Сравнительный анализ поражений с помощью целевого подхода к секвенированию
November 5th, 2019
В этой статье описывается метод выявления клональных и субклональных изменений между различными образцами от данного пациента. Хотя описанные здесь эксперименты сосредоточены на определенном типе опухоли, этот подход в целом применим к другим твердым опухолям.
Наш протокол позволяет зафиксировать генетическую связь между первичными и метастатическими поражениями путем выявления молекулярных изменений, связанных с прогрессированием заболевания. Наш метод дает возможность исследовать генетическую родственность в клиническом образце с высокой чувствительностью и специфичностью. Это связано с интеграцией молекулярного и гистопатологического анализа.
Оценка внутриопухолевая неоднородность в области исследований рака имеет первостепенное значение при разработке эффективных противоопухолевых стратегий, и наш метод широко применим ко многим типам твердых опухолей. После подготовки и количественной оценки библиотек, представляющих интерес, разбавить каждую библиотеку до 100 пикомолярной концентрации в нуклеазной воде и объединить 10 микролитров каждой разбавленной библиотеки для одного запуска в одной трубке. Затем смешайте объединенные библиотеки с помощью пипетки.
Чтобы инициировать секвенирование запуска, сначала откройте браузер Torrent на компьютере, подключенном к системе секвенирования. Запланируйте новый запуск с использованием общего шаблона для выбранного приложения и под вкладкой комплектов выберите систему Ion Proton или систему Ion Gene Studio S5. Выберите соответствующий чип из меню высадки типа чипа и выберите библиотечный набор Ion AmpliSeq 2.0 из списка высадок библиотечного комплекта.
Выберите кнопку Ion Chef для набора шаблонов и выберите соответствующий комплект шеф-повара из списка отсечки комплекта шаблонов. Выберите соответствующий комплект секвенирования из меню секвенирования комплекта высадки и выберите Ion Express из списка высадок штрих-кодов. Под вкладкой плагина выберите плагин анализа покрытия.
В соответствии с вкладкой плана выберите геном GRCH37HG19 из списка отсева справочной библиотеки. Из списка отсеек целевых регионов выберите соответствующую панель, которая будет секвенирована. Затем установите количество штрих-кодов, которые будут секвенированы, и установите имя штрих-кода и имя образца для каждой библиотеки.
Для разбавления объединенных библиотек разбавить фондовую библиотеку водой без нуклеазы до 25 пикомолярной концентрации для ионного протонного чипа и пипетки 50 микролитров каждой разбавленной библиотеки на дно соответствующей библиотеки образца трубки. Загрузите пробные трубки, содержащие объединенные разбавленные библиотеки, в систему подготовки библиотек и начните клоническое усиление. Для последовательности следующего поколения следуйте инструкциям на экране для инициализации инструмента.
Когда клоническое усиление будет закончено, откройте дверь инструмента Ion Chef, затем откройте крышку центрифуги загрузки чипа и удалите две фишки из системы подготовки библиотеки. Поместите чипы в отдельные контейнеры для хранения чипов и загрузите одну из микросхем в отсек чипа в приборе. Затем закройте крышку чипового отсека и начните секвенирование.
Для анализа мутаций откройте плагин анализа покрытия и используйте результаты анализа покрытия для проверки глубины охвата и единообразия. Используйте плагин Torrent Variant Caller для выполнения варианта вызова выбора зародышевой линии или соматический рабочий процесс по мере необходимости. Затем загрузите фильтрованные варианты вариантов файлов формата вызова и используйте программное обеспечение предиктора эффекта варианта в базе данных NCBI RefSeq, чтобы аннотировать варианты.
Чтобы оценить вариации копий-числа, используйте плагин загрузчик ионных репортеров для загрузки данных секвенирования в программное обеспечение ионных репортеров и использовать всеобъемлющий рабочий процесс опухоли панели рака нормальной пары для анализа данных. Вручную фильтруйте мутации и вариации копий на основе баллов, назначенных программным обеспечением, и проверяйте вариации визуально с помощью интегративного зрителя геномики. Затем визуально проинспектируйте выравнивание для необычных считываний, которые могут генерировать артефактные вызовы и проверить нормализованное покрытие для всех ампликонов через данный ген против нормализованного покрытия базового уровня для проверки вариаций числа копий.
Для каждого случая, индекс мутации звонки от секвенирования нормальной ткани или крови или первичной опухоли или метастазов. Пометить как зародыш линии и отказаться звонки, которые также очевидны из секвенирования данных зародышевой линии ДНК. Пометить в качестве клона или основателя мутации, которые разделяются между всеми поражениями данного пациента.
Затем пометить в качестве субклонального или прогрессора мутации, которые обнаруживаются в некоторых, но не все поражения данного пациента. В этом репрезентативном эксперименте секвенирование нескольких поражений пяти твердых псевдопапилярных неоплазмных случаев, направленных на кодирование последовательностей 409 генов, связанных с раком, выявило в общей сложности 27 соматических мутаций в восьми генах. Мутации были определены как основатель или клональный, когда разделяют между всеми поражениями данного пациента и прогрессора или субклонального при обнаружении в некоторых, но не все поражения данного пациента.
Последовательно иммуногистохимическое окрашивание для бета-катенина и KMD6A было однородным среди разнообразных поражений случаев с мутациями соответствующих генов. Умеренное окрашивание KMD6A в мутировавших образцах предполагает, что генетическое изменение может изменить функцию, а не экспрессию белка. Потеря функции KMD6A в опухолях поджелудочной железы связана с регуляцией гипоксии маркера GLUT-1.
И соответственно, GLUT-1 был более выражен в случаях, несущих мутации KMD6A. Иммуногистохимия для BAP1 и TP53 подтвердила, что мутации в этих генах были субклональными. В этом виртуальном кариотипе репрезентативного случая, показывающего расположение, близость и статус числа копий измененных генов, анализ вариаций копий с использованием данных секвенирования выявил изменения во всех анализируемых образцах.
И в отличие от точечных мутаций, большинство изменений вариации копий были субклональными. Проверка и индексация мутаций и вариации копий и числа и использование опухоли нормальное сравнение ДНК имеют важное значение для избежания генерации артефактных вызовов, которые могли бы признать результаты недействительными. Эта процедура также может быть применена к исследованиям секвенирования всего генома, направленным на изучение всего генома для выявления мутаций между поражениями различных типов твердых опухолей.
В области исследований рака эти методы являются важнейшими инструментами для понимания биологии заболеваний с важными клиническими последствиями, направленными на разработку персонализированных и эффективных целевых методов лечения.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Эта статья описывает метод идентификации клональных и субклональных изменений среди различных образцов от данного пациента. Подход позволяет захватывать генетическую связь между первичными и метастазирующими поражениями, предоставляя представление о прогрессировании заболевания.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Онкология
- Генетика
- Молекулярная биология
Предыстория
- Понимание внутриопухолевой гетерогенности важно для эффективного лечения рака.
- Идентификация молекулярных изменений может помочь в разработке антиопухолевых стратегий.
- Метод интегрирует молекулярный и гистопатологический анализ.
- Он применим к различным типам опухолей твердых органов.
Цель исследования
- Исследовать генетическую связь в клинических образцах.
- Оценить молекулярные изменения, участвующие в прогрессировании рака.
- Улучшить чувствительность и специфичность генетического анализа.
Используемые методы
- Подготовка и количественное определение библиотек, представляющих интерес.
- Разбавление библиотек до концентрации 100 пикмоляр.
- Объединение разбавленных библиотек для анализа.
- Пипетирование для смешивания объединенных библиотек.
Основные результаты
- Метод позволяет высокочувствительное обнаружение генетических изменений.
- Он предоставляет представление о клональной эволюции опухолей.
- Результаты применимы к ряду опухолей твердых органов.
- Способствует лучшему пониманию гетерогенности опухолей.
Выводы
- Подход эффективен для изучения генетической связи в раке.
- Он может информировать разработку таргетной терапии.
- Широкая применимость повышает его полезность в исследованиях рака.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Comparative lesions analysis using targeted sequencing directly addresses the challenge of intra-tumoral heterogeneity, a key barrier to effective targeted therapy development. By distinguishing clonal from subclonal alterations across primary and metastatic lesions, this approach enhances predictive confidence in target validation and informs risk-adjusted portfolio decisions. Integrating molecular, histopathological, and immunophenotypic data supports robust mechanistic de-risking at critical discovery and translational inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise mapping of clonal and subclonal mutations to clarify therapeutic hypotheses.
- Supports functional target validation by integrating genetic and immunophenotypic evidence.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing the evolutionary landscape of tumor lesions.
- Improves predictive confidence for advancing targets with consistent clonal alterations.
Screening & Assay Development
- Prepares validated lesion-derived samples for downstream molecular and functional assays.
- Standardizes sequencing and variant calling workflows for reproducible quantitative outputs.
- Enables robust detection of somatic alterations for reliable compound evaluation in disease-relevant systems.
- Supports scalability and platform reuse across multiple tumor types and studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic findings with immunophenotypic biomarkers for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by distinguishing driver from passenger mutations in preclinical models.
- Provides a framework for integrating multi-lesion data into personalized therapy design strategies.
- Supports disease-relevant system selection based on clonal architecture and biomarker expression.
Pipeline & Workflow Integration
This targeted sequencing approach integrates from early discovery through translational research, supporting lead identification and preclinical validation when genetic heterogeneity is a key risk factor.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by mapping mutation clonality across lesions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative variant and copy-number outputs for assay readiness.
- Analytics: Provides high-sensitivity detection and annotation of somatic alterations for cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects genetic and immunophenotypic data to biomarker alignment and preclinical model selection.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, broadly applicable workflow for multi-lesion analysis across solid tumor portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible sequencing and analysis workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management by clarifying clonal architecture.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of assets based on robust genetic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular pathology, next-generation sequencing, and bioinformatics analysis.
- Demands access to high-coverage sequencing platforms and validated analytical software.
- Necessitates rigorous sample processing and neoplastic cell enrichment for artifact minimization.
- Benefits from cross-team standardization of variant calling and immunophenotypic assessment protocols.
- May be limited by the targeted gene panel scope and sample quality constraints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:48
Library Pooling and Sequencing Run
2:28
Sample Library Dilution and Loading
3:00
Next Generation Sequencing
3:43
Mutation and Copy-Number Variation (CNV) Analysis
5:00
Somatic Mutation Indexing
5:36
Results: Representative Comparative Lesion Analyses
7:16
Conclusion
