ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Турью Канти Дебнатх за помощь в ChemDraw. Исследования в лаборатории Xhemal'e поддерживается Министерством обороны - Конгресс направлены медицинские исследования программы - Рак молочной железы Прорыв премии (W81XWH-16-1-0352), NIH Грант R01 GM127802 и запуск средств от Института сотовой и Молекулярная биология и Колледж естественных наук техасского университета в Остине, США.

<ol><li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+histones+to+RNA%3A+role+of+methylation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+Watches+the+Watchmen%3A+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139(2016).</li>
<li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+methylation+of+m%286%29Am+in+the+5%27+cap+controls+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li>
<li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U6+snRNA+m%286%29A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27+UTR+m%286%29A+Promotes+Cap-Independent+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%286%29-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li>
<li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li>
<li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li>
<li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998(2012).</li>
<li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protocols%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li>
<li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82(2003).</li>
<li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li>
<li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+%28rRNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Здесь сообщается о простом и надежном методе проверки РНК-метилтрансферазы в отношении конкретных транскриптов. Ассаи использует тот факт, что S-аденосил метионин может быть тритиациарет на метилгруппы донора(рисунок 1), что позволяет метилированной РНК быть точно обнаружены без использования антител. Однако, важно отметить, что этот анализ не может указать, какие остатки или химической группы метилируется ферментом. Для выявления или проверки того, что конкретный остаток метилирован, другие...

ДНК, РНК и белки подвержены изменениям, которыежестко регулируют экспрессию генов 1. Среди этих модификаций метилирование происходит на всех трех биополимерах. Метилирование ДНК и белка было очень хорошо изучено в течение последних трех десятилетий. В отличие от этого, интерес к метилированию РНК был только недавно возродился в свете важной роли, что белки, которые пишут, стирают или связывают РНК метилациляции играют в развитии и болезни2. В дополнение к более известным функциям в обильных рибосомных и передачи РНК, РНК метилирования пути регулируют конкретные посыльного РНК стабильности3,4, сращивание5 и перевод6,7, miRNA обработки8,9 и транскрипционной паузы и выпуска10,11.
Здесь сообщается о простом и надежном методе проверки РНК-метилтрансферазы в условиях лаборатории молекулярной биологии (обобщено на рисунке 1). Многие исследования оценивают активность РНК метилтрансферазы через точечную подрамность с антителом против изменения интереса РНК. Однако, точка-блот не проверяет целостность РНК при инкубации с метилтрансферазой РНК. Это важно, потому что даже незначительные загрязнения рекомбинантных белков с нуклеазой может привести к частичной деградации РНК и смешанные результаты. Более того, даже высокоспецифические антитела к модификации РНК могут распознавать неизмененные РНК с определенными последовательностями или структурами. In vitro RNA метилтрансферазы анализ сообщил здесь использует тот факт, что S-аденосил метионин может быть трилциатна на метиловой группы донора (Рисунок 1), что позволяет метилированной РНК быть точно обнаружены без использования антител . Инструкции предусмотрены для экстракорпорной транскрипции и очистки стенограммы интереса и тестирования метилирования указанной транскрипта ферментом интереса. Этот метод является гибким и надежным и может быть скорректирован в соответствии с потребностями того или иного проекта. Например, в пробирке транскрибируются и очищены РНК, химически синтезированные РНК, но и клеточные РНК могут быть использованы. Этот ассси обеспечивает количественную информацию в виде сцинтилляции, а также качественную информацию, показывая, где именно метилированная РНК работает на геле. Это может обеспечить уникальное понимание функции РНК метилтрансферазы, особенно при использовании клеточных РНК в качестве субстрата, так как он обеспечивает метод непосредственного наблюдения размер РНК или РНК, которые предназначены для метилирования.

<table><tbody><tr><td>10 b.p DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10821-015</td><td>10 b.p DNA Ladder kit.</td></tr><tr><td>10% персульфат аммония (APS)</td><td>Н/Д</td><td>Н/Д</td><td>Для полиакриламидного геля для денатурации мочевины (Для 10 мл растворите 1 г в 8 мл воды milliQ; отрегулируйте объем до 10 мл с помощью воды milliQ; отфильтруйте раствор с помощью шприца объемом 10 мл, оснащенного 0,45 & микро; м).</td></tr><tr><td>10X TBE Buffer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Для денатурирующего мочевину полиакриламидного геля (Для 1 л добавьте 108 г трисового основания, 55 г борной кислоты в цилиндр с мешалкой; добавьте 800 мл дистиллированной воды и дайте раствориться; добавьте 40 мл 0,5 М Na2EDTA (pH 8,0); отрегулируйте объем до 1 л с помощью milliQ воды; отфильтруйте раствор с помощью 0,22&микро; м).</td></tr><tr><td>10 столовых ложек</td><td>н/д</td> н<td>/д</td><td>Для 1 л добавьте 60,5 г Tris Base, 87,6 г NaCl в цилиндр с мешалкой; добавьте 800 мл дистиллированной воды и дайте раствориться; отрегулируйте pH до 7,5 с помощью концентрированной HCl; отрегулируйте объем до 1 л с помощью milliQ воды; отфильтруйте раствор с помощью 0,22 & микро; m filter.&nbsp;</td></tr><tr><td>Акриламид: бис-акриламид 29:1 (40% раствор/электрофорез), биореагенты Fisher</td><td></td><td>BP1408-1</td><td>Для мочевины денатурирующий полиакриламидный гель.</td></tr><tr><td>АДЕНОЗИЛ-L-МЕТИОНИН, S-[МЕТИЛ-3H]; (ЗРК[3H])</td><td>Перкин Элмер</td><td>NET155V250UC</td><td>Для метилирования РНК in vitro; Концентрация = 1,0 мКи/мл; Удельная активность = 17,1 Ди/ммоль; Молярность = (1,0 Ки/л)/(83,2 Ки/ммоль) = 0,0584 ммоль/л = 58,4 &микро;M.&nbsp; &nbsp; После получения замороженной трубки 3H-SAM, разморозьте ее при температуре 4°С; С, 20 и микро; L aliquots, и заморозьте их при -30°C. Никогда не замораживайте повторно и не используйте частично использованную аликвоту.</td></tr><tr><td>Гиперкассетные кассеты для авторадиографии Amersham</td> GE <td>Healthcare</td><td>RPN11649</td><td>для экспонирования гелем на авторадиограмме.</td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm MP</td><td>GE Healthcare</td><td>28906846</td><td>Для экспонирования гелем авторадиограммы.</td></tr><tr><td>Счетчик сцинтилляции Beckman</td><td></td><td>LS6500</td><td>Для жидкостного сцинтилляционного подсчета.</td></tr><tr><td>Мини система горизонтального электрофореза Biorad</td><td></td><td>1704466</td><td>мини система горизонтального электрофореза.</td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free Protage Inhibitor Cocktail</td><td>Tablets Roche Applied Science</td><td>4693159001</td><td>Для раствора 20X растворите 1 таблетку в 0,525 мл воды, не содержащей нуклеазы.</td></tr><tr><td>Criterion Cell</td><td>Biorad</td><td>345-9902</td><td>РНКаза свободная пустая кассета для полиакриламидного геля.</td></tr><tr><td>Criterion пустые кассеты</td><td>Biorad</td><td>1656001</td><td>Вертикальная ячейка для электрофореза миди формата.</td></tr><tr><td>DeNovix DS-11 Микрообъемный спектрофотометр</td><td>DeNovix</td><td>DS-11-S</td><td>Микрообъемный спектрофотометр для измерения концентрации ДНК и РНК.</td></tr><tr><td>Ecoscint Original</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-271</td><td>Для жидкостного сцинтилляционного подсчета.</td></tr><tr><td>Fisherbrand 7 мл HDPE Сцинтилляционные флаконы</td><td>Fisher</td><td>03-337-1</td><td>Для жидкого сцинтилляционного подсчета.</td></tr><tr><td>Фтор-Ганс-Быстродействующий усилитель авторадиографии</td><td>RPI CORP</td><td>112600</td><td>Для предварительной обработки гелем авторадиограммы.</td></tr><tr><td>Гелевая сушилка</td><td>Biorad</td><td>1651745</td><td>Для сушки геля.</td></tr><tr><td>Гелевый загрузочный буфер II</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td>Для загрузки РНК в денатурирующий полиакриламид мочевинный гель (состав: 95% формамид, 18 мМ ЭДТА и 0,025% SDS, ксилолцианол и бромфеноловый синий).</td></tr><tr><td>Одноразовые насадки для иссечения геля GeneCatcher</td><td>Gel Company</td><td>NC9431993</td><td>Для удаления полос из агарозных и полиакриламидных гелей.</td></tr><tr><td>Megascript Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1333</td><td>Для транскрипции in vitro с РНК-полимеразой Т7.</td></tr><tr><td>Perfectwestern Extralarge Container</td><td>Genhunter Corporation</td><td>NC9226382 (прозрачный)/ NC9965364 (черный)</td><td>Коробка для окрашивания гелем.</td></tr><tr><td>pRZ</td><td>Addgene</td><td>#27663</td><td>Плазмида для получения транскриптов in vitro с однородными концами</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Для очистки РНК используйте модифицированный протокол, предусмотренный в протоколе.</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Набор для экстракции геля и очистки фрагмента дцДНК, используемого для транскрипции in vitro.</td></tr><tr><td>Saran Premium Plastic Wrap Saran</td><td>Wrap</td><td>Amazon</td><td>Для сушки геля.</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>Ультрачувствительный гель для нуклеиновых кислот.</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Гель-краситель для нуклеиновых кислот.</td></tr><tr><td>TE</td><td>Sigma</td><td>93283-100ML</td><td>10 мМ Tris-HCl, 1 мМ динатрия ЭДТА, pH 8,0</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>110-18-9</td><td>Для мочевины денатурирующий полиакриламидный гель.</td></tr><tr><td>Термомиксер с SMARTBLOCK 24X 1,5 мл TUBES</td><td>eppendorf</td><td>5382000023/5361000038</td><td>Для инкубации пробирок объемом 1,5 мл с регулируемой температурой.</td></tr><tr><td>TOPO TA Cloning Kit</td><td>Life technologies</td><td></td><td>Наборы для быстрого клонирования Taq-полимеразы; амплифицировали продукты ПЦР в векторы, содержащие промоторы T7 и/или SP6 для транскрипции РНК in vitro.</td></tr><tr><td>ТУРБО ДНКаза (2 U&frasl; &микро; L)</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>Для удаления ДНК из реакций транскрипции in vitro.</td></tr><tr><td>Мочевина</td><td>Sigma</td><td>51456-500G</td><td>Для мочевины денатурирующий полиакриламидный гель.</td></tr><tr><td>Ватман 3мм бумага</td><td>GE Healthcare</td><td>3030-154</td><td>Хроматографическая бумага для сушки геля.</td></tr></tbody></table>

Антитела-бесплатный анализ для анализа активности РНК метилтрансферазы

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

Существует более 100 химически различных модификаций РНК, две трети из которых состоят из метилирования. Интерес к изменениям РНК, и особенно метилирования, вновь появился из-за важной роли, которую играют ферменты, которые пишут и стирают их в биологических процессах, имеющих отношение к болезням и раку. Здесь, чувствительный анализ in vitro для точного анализа деятельности писателя метилирования РНК на синтетических или in vitro транскрибированных РНК предоставляется. В этом ассее используется тритированная форма S-аденосил-метионина, что приводит к прямой маркировке метилированной РНК тритием. Низкая энергия излучения трития делает метод безопасным, а уже существующие методы усиления сигнала трития позволяют количественно и визуализировать метилированную РНК без использования антител, которые обычно подвержены артефактам. Хотя этот метод написан для РНК метилирования, несколько настроек сделать его применимым к изучению других изменений РНК, которые могут быть радиоактивно помечены, такие как РНК ацетилирование с 14C ацетил кофермент A. В целом, этот вывод позволяет быстро оценить РНК метилирование условия, ингибирование с небольшими ингибиторами молекулы, или эффект РНК или фермента мутантов, и обеспечивает мощный инструмент для проверки и расширения результатов, полученных в клетках.

Реакция транскрипции в пробирке Рисунок 2 A представляет собой типичный пробег от реакции транскрипции in vitro с полимеразой РНК T7 7SK snRNA, которая является относительно короткой (331 nt) и высоко структурированной РНК. Как показано на этом исходном изображении, есть несколько нежелательных полос, как короче, так и дольше, чем 7SK, вероятно, в результате случайных транскрипционных событий инициации или прекращения. Из-за этого, очистка геля после реак...

Здесь описывается анализ антител без пробирки для прямого анализа активности метилтрансферазы на синтетической или в пробирке транскрибированной РНК.

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Существует более 100 различных модификаций РНК, две трети из которых являются метилированиями. Этот протокол обеспечивает метод для чувствительного и точного анализа деятельности писателя метилирования РНК. Этот простой в использовании метод позволяет количественно и визуализировать метилированную РНК без использования антител, которые обычно подвержены артефактам.Демонстрацией процедуры будет Саманта Шелтон, аспирантка из моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, установите 100-микролитр РНК метилтрансферазы анализ в 1,5-миллилитровой трубки на льду, как указано в текстовом протоколе. Vortex трубки тщательно перемешать, и центрифуга в 200 раз г в течение пяти секунд, чтобы собрать раствор в нижней части трубки.Инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. Затем очистите реакцию с помощью очистки столбца, как указано в текстовом протоколе. Для выполнения подсчета жидких сцинтилляций найте стойку подсчета сцинтилляции одним флаконом на образец, одним флаконом для фонового измерения и одним флаконом для теста салфетки.Заполните флаконы пятью миллилитров раствора для подсчета сцинтилляции. Добавьте 10 микролитров каждого элеватора радиоактивного образца РНК в один флакон. Затяните крышку и аккуратно перемешайте.Чтобы подготовить пробные флаконы, тщательно протирать ватные тампоны на всех поверхностях и оборудовании, используемом во время процедуры. Добавьте эти тампоны во флаконы, наполненные раствором сцинтилляции, и затяните крышку. Для запуска образцов на счетчике сцинтилляции откройте капот счетчика, вставьте стойку в машину и закройте капот.Выберите граф одноместный стойку. Выберите программу выбора пользователя. Выберите или создайте программу, которая измеряет тритий в течение 60 секунд, и ударил граф Стойка.Повторите количество сцинтилляции три раза. После этого подготовь и повторно запустите денатурированный полиакриламидный гель мочевины, как указано в текстовом протоколе. Перенесите 20 микролитров радиоактивного РНК-материала в новую 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 20 микролитров буфера загрузки 2X геля.После подготовки лестницы, инкубировать образцы при 70 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Вымойте колодцы геля еще раз непосредственно перед загрузкой образца путем трубопроводного буфера из гелеобразуемых резервуаров вниз в колодцы геля. Затем загрузите 20 микролитров подготовленной лестницы, 20 микролитров образцов и 20 микролитров буфера загрузки геля в полосы движения геля.Вы запустите гель на 100 вольт в течение 60 до 180 минут, в зависимости от процента полиакриламинида. После того, как гель закончил работать, удалить гель из кассеты и поместить его в коробку, содержащую 50 миллилитров буфера 1X TBE с пятью микролитров сверхчувствительных нуклеиновых кислот гель пятно. Инкубировать на рокер в течение пяти минут, чтобы испачкать РНК.После этого осторожно вывихите гель из коробки и поместите его на УФ-трансиллюминатор системы визуализации геля с колодцами вверх и лестницей слева. Сосредоточьте камеру на геле, включите ультрафиолетовый свет и сделайе снимок геля. Затем выключите УФ-облучение и сохраните изображение в качестве файла TIFF.Поместите гель обратно в коробку, удалите TBE, и исправить гель с 50 миллилитров фиксации раствора на рокер при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем аккуратно переместите гель в свежий черный ящик, содержащий 25 миллилитров раствора для повышения ауторадиографии. Инкубировать на рокер при комнатной температуре в течение 30 минут.Аккуратно поднимите гель и поместите его лицом вниз на лист полиэтиленовой пленки с колодцами вверх и лестницей на правой стороне. Поместите два листа хроматографической бумаги на заднюю часть геля и переверните весь стек. Предварительно разогреть фен до 80 градусов по Цельсию.Перемести пластиковую крышку на фен обратно. Вставьте весь стек под пластиковую крышку, и переместить пластиковую крышку обратно вниз, чтобы создать уплотнение. Высушите гель при 80 градусах по Цельсию в течение одного часа.Затем выключите фен и аккуратно удалите стек. Снимите обертку и вторую хроматографическую бумагу. Лента оставшейся хроматографической бумаги с сушеным гелем в авториадиограмме кассеты.В темной комнате добавьте один лист авторадиографической пленки. Храните кассету при отрицательных 80 градусах по Цельсию и развивайте пленку в соответствующее время, в зависимости от интенсивности сигнала. После того, как пленка разработана, поместите его на верхней части кассеты и использовать лабораторный маркер, чтобы тщательно отметить четыре края геля, каждый хорошо, и положение XC и BB красителей.Сканируйте пленку с разрешением 300 или 600 пикселей на дюйм и сохраните изображение в качестве файла TIFF. В этом исследовании, без антител анализ продемонстрирован для анализа активности РНК метилтрансферазы. Типичный пробег от реакции транскрипции in vitro с полимеразой T7 РНК небольшой ядерной РНК 7SK показывает относительно короткую и высоко структурированную РНК.Есть несколько нежелательных полос, как короче, так и дольше, чем 7SK, вероятно, в результате случайных транскрипционных событий инициации или прекращения. Из-за этого, гель очистки после реакции транскрипции in vitro важно получить чистый образец РНК. На этом этапе РНК, представляющие интерес, может быть идентифицирована по своему расположению относительно лестницы и очищена путем очистки геля.Здесь показан репрезентативный анализ РНК метилтрансферазы с использованием нижнего предела рекомендуемой концентрации РНК и белка. Этот анализ позволяет как количественные результаты от сцинтилляции рассчитывает, а также качественные результаты от авторадиограммы. Здесь, РНК метилтрансферазы, как известно, метилат 7SK показано, что в состоянии также метилировать U6. Кроме того, как недавно показано на 7SK, связывание гистона H4 с MePCE также препятствует метилированию U6.Это можно наблюдать как при подсчете сцинтилляции, так и в авторадиограмме, демонстрируя надежность этого протокола. РНК подвержена деградации, поэтому, пожалуйста, убедитесь, что использовать RNase свободных реагентов и тщательно очистить все поверхности и оборудование. Радиоактивно помеченная РНК, полученная из анализа метилтрансферазы, может быть непосредственно использована для оценки активности РНК-деметилазы или активности связывания РНК с помощью анализа электрофоретической смены подвижности, например.Этот метод позволяет исследователям проверить влияние различных факторов на активность РНК метилтрансферазы, включая точечные мутации и лечение ингибиторами малых молекул. Этот метод использует радиоактивный материал, поэтому не забудьте носить соответствующие СИЗ, и быть осторожным во время обработки и утилизации радиоактивных материалов.

antibody-free-assay-for-rna-methyltransferase-activity-analysis

Research

JoVE Journal

Genetics

Генетика

Этот протокол описывает подготовку синтетический субстрат для...

В пробирке тРНК метилирования Пробирной с Entamoeba histolytica ДНК и тРНК метилтрансферазы Dnmt2 (Ehmeth) Фермент

Модифицированный северный блоттинг метод измерения N 6 -methyladenosine (м 6 а) изменения в РНК описана. Текущий метод может обнаружить изменения в различных РНК и элементов управления в различных экспериментальных конструкций.

Метод для измерения РНК<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Изменения в клетках и тканях

Здесь мы описываем протокол для биохимических характеристик РНК изменение фермента дрожжей, Mod5 и обсудить, как этот протокол может применяться для других РНК модификация ферментов.

In Vitro Assay для обнаружения деятельности трансферазы tRNA изопентенил

Здесь мы представляем протокол для DNAzyme-зависимого расщепления РНК. Это позволяет быстро и на основе места анализа РНК 2'-O-метилирования. Этот подход может быть использован для предварительной или крупной оценки активности сноРНА.

Днк-зависимый анализ rRNA 2'-O-Метилирования

Анализ иммунопреципиентации метилированной РНК является методом на основе антител, используемым для обогащения метилированных фрагментов РНК. В сочетании с глубоким секвенированием, это приводит к идентификации стенограмм с модификациейm 5C.

Метилированная РНК Иммунопреципиентация Анализ для изучения m5C Модификация в Arabidopsis

Эти протоколы предоставляют методологию, используемую для оценки ферментативной активности отдельных членов семейства белков аргининметилтрансферазы (PRMT) в клетках. Описаны подробные рекомендации по оценке активности PRMT с использованием эндогенных и экзогенных биомаркеров, антител, распознавающих метиларгинин, и ингибиторных инструментальных соединений.

Количественные методы изучения активности белка аргининметилтрансферазы 1-9 в клетках

Роль модификаций РНК в вирусных инфекциях только начинает изучаться и может выявить новые механизмы взаимодействия вируса и хозяина. В этой работе мы предоставляем конвейер для исследования модификаций РНК m6A и m5C в контексте вирусных инфекций.

Изучение эпитранскриптомов m6A и m5C при вирусной инфекции: пример с ВИЧ

ДНК-метилтрансферазы являются потенциальными мишенями лекарств от рака. Здесь представлен протокол для оценки малых молекул ингибирования ДНК-метилтрансферазы. Этот анализ использует эндонуклеазу для соединения метилирования ДНК с генерацией флуоресценции и позволяет контролировать активность ферментов в режиме реального времени.

Непрерывный флуоресцентный анализ метилирования ДНК на основе эндонуклеазы для скрининга ингибиторов ДНК-метилтрансферазы

Здесь мы представляем протокол для полуколичественной оценки глобальных уровней m⁶A с помощью точечного блота. Общая РНК извлекается, денатурируется, выявляется на нейлоновой мембране, пробуется антителом против m⁶A и визуализируется с помощью хемилюминесценции. Интенсивность сигнала, количественно измеряемая с помощью серого анализа ImageJ, отражает относительное количество метилирования, обеспечивая воспроизводимый рабочий процесс для исследований.

Анализ с точками для обнаружения глобальных уровней модификации РНК N6-метиладенозина

Здесь мы подробно остановимся на способе S- выравнивания P soralen, сшитого, Ligated, и S, выбранного H ybrids (SPLASH), который позволяет проводить генома внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия РНК-РНК in vivo . SPLASH может применяться для изучения РНК-взаимодействий организмов, включая дрожжи, бактерии и людей.

Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Изучите антитела-бесплатный анализ активности РНК метилтрансферазы с использованием тритированного S-аденозилметионина. Этот метод позволяет количественно и качественно оценивать метилирование РНК без артефактов антител.

Антитела-бесплатный анализ для анализа активности РНК метилтрансферазы

Больше видео