Роман Никотинамид Аденин Динуклеотид Метод коррекции для внутриклеточного Измерения Ca2 "с Fura-2-Analog в живых клетках
20 сентября 2019 г.
Из-за спектрального перекрытия возбуждения и длины волн выбросов аналогов NADH и fura-2, сигнальные помехи от обоих химических веществ в живых клетках неизбежны во время количественного измерения «Ca2». Таким образом, был разработан новый онлайн-метод коррекции помех сигнала NADH для измерения «Ca2».
УФ возбудимые множественные зонды, имеют присущее сигнальное загрязнение, из-за автоматического множественного числа звуков. Большая часть проблемы с NADH, ограничивает использование множественного числа зонда. Метод может быть использован, чтобы точно исправить внешнюю флуоресценцию от NADH, для того, чтобы извлечь истинный, незагрязненый сигнал множественного числа зонда.
Демонстрацией процедуры будет Чон Хун Ли, наш доцент из моей лаборатории. После того, как миоциты оседают на дне трубки, аспирируют супернатант. Этикетка клеток с двумя миллилитров свежеприготовленных один миллимолярный фура-2-FFAM разбавления раствора в течение 60 минут при четырех градусах по Цельсию.
В конце инкубации поместите трубку в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 30 минут в вертикальном положении, прежде чем удалить супернатант. Затем добавьте четыре миллилитров среды культуры комнатной температуры для хранения при комнатной температуре. Ибо на месте isobestic фура-2-ffa точки идентификации горе разбавленных клеток на стадии микроскопа и ждать три минуты для клеток, чтобы опуститься на дно.
Профанный NADH-бесплатный 37 градусов по Цельсию без кальция раствор в клеточной культуре и найти целевую клетку. Профанный раствор сапонина в течение 60 секунд, прежде чем повторно профанать с NADH-бесплатный раствор без кальция. Одновременно измеряйте сигналы фуры-2-ff на 450 и 500 нанометров, используя возбудительный скан от 350 до 365 нанометров с шагом 0,1 нанометров и повторно обитая с раствором без кальция NADH.
Далее вычесть сигналы в растворе кальция насыщенных от сигналов в условиях, свободных от кальция. Затем вычислите стандартные отклонения излучения при каждом возбуждении и выберите длину волны возбуждения, показывающую минимальные стандартные значения отклонения в качестве отдельных точек изобестики. Чтобы использовать многопамарометрическую систему измерения для обнаружения фонового сигнала и коррекции сигнала в области клетки, монтировать клетки без красителя в ванне микроскопа и позволить клеткам осесть в течение трех минут.
Профанный раствор NADH без кальция в ванну в течение примерно пяти минут со скоростью от двух до трех миллилитров в минуту и установить объект поле для покрытия целевой клетки. После перемещения ячейки из поля измеряют фоновые сигналы свободного от ячейки окна и устанавливают сигналы в качестве смещений. Затем верните ячейку в исходное положение и измерьте фоновые сигналы клетки и область клетки.
Для расчета R-фактора используйте приобретенные клеточные фоновые и областные сигналы перед перемонтированием клеток, свободных от красителей, на микроскоп и изобилием раствором без кальция. Измерьте сигналы, как указано, прежде чем обитать клеточной подвески с раствором малата. После измерения сигналов обильно клетки с пируватным раствором следуют изобилие с раствором малат-пируват и раствором ротенона.
Затем вычислите наклон для каждого сигнала. Здесь показаны изменения митохондриального кальция до и после коррекции. Результаты ясно показывают существенные изменения в митохондриальном кальции с митохондриальной концентрацией кальция отдыха без цитозолового кальция 1.03 плюс или минус 0.13 микромолара и максимального митохондриального кальция на одном микромоле кальция 29.6 плюс или минус 1.61 микромолара.
Митохондриальный трансмембранный потенциал отслеживался с использованием двух наномоларов TMRE. Изменение митохондриального потенциала было рассчитано на основе предполагаемого первоначального митохондриального мембранного потенциала в минус 150 милливольт, демонстрируя снижение NADH в ответ на добавление кальция, с неопоясным воздействием на митохондриальный мембранный потенциал. Митохондиральный рН не был вызван увеличением митохондриального кальция, вызванного нагрузкой carboxy SNARF-1.
Неправильные изобетические точки приводят к неправильной коррекции R и NADH. Так что позаботьтесь, чтобы всегда правильно измерить безклеточный фон и область клетки. Этот метод используется для подготовленных митохондриальных динамических исследований кальция в биоаналитических разливов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данное исследование посвящено решению проблемы интерференции сигналов от NADH и аналогов fura-2 при измерении концентрации кальция в живых клетках. Был разработан новый метод онлайн-коррекции для повышения точности измерений [Ca2+] в условиях загрязнения сигнала NADH.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Помехи сигнала при флуоресцентных измерениях
- Измерение уровня кальция в живых клетках
- Разработка методов коррекции
Теоретические основы
- Спектральное перекрытие длин волн возбуждения и эмиссии осложняет проведение измерений.
- NADH может ограничивать эффективность использования нескольких зондов в флуоресцентной микроскопии.
- Точные измерения [Ca2+] имеют решающее значение в исследованиях клеток.
Используемые методы
- Измерение флуоресценции с помощью fura-2
- Клеточные анализы с использованием миоцитов
- Методы коррекции сигнала и измерение фонового сигнала
Основные результаты
- Наблюдались значительные изменения концентрации кальция в митохондриях.
- Разработан систематический подход для коррекции интерференции NADH.
- Метод был подтвержден с помощью строгих экспериментальных процедур.
Выводы
- В данном исследовании успешно продемонстрирован метод повышения точности измерения флуоресценции.
- Это имеет важное значение для количественного анализа в клеточной биологии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для профильной отрасли
Точное измерение внутриклеточного кальция имеет решающее значение для валидации мишеней при разработке лекарственных препаратов, особенно для митохондриальных сигнальных путей. Автофлуоресценция NADH создает значительные помехи в анализах с использованием fura-2, что снижает достоверность данных и увеличивает частоту ложноположительных результатов на этапе первичного скрининга. Данный метод коррекции NADH повышает прогностическую уверенность за счет выделения истинных сигналов кальция, что способствует снижению механистических рисков в программах по разработке препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний и нарушений обмена веществ.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать механизмы регуляции митохондриального кальция в качестве терапевтической гипотезы в моделях заболеваний.
- Практическая ценность: снижает неопределенность механизмов за счет отделения автофлуоресценции NADH от истинных сигналов fura-2.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени благодаря количественным измерениям потока кальция без интерференции.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений путем установления базового уровня флуоресценции с поправкой на NADH.
- Воспроизводимость: Стандартизация выбора длины волны возбуждения путем определения изобестической точки, что минимизирует вариабельность между анализами.
- Возможность мультиплексирования: Поддержка одновременного измерения NADH, кальция и pH или мембранного потенциала с использованием различных наборов возбуждения/эмиссии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для медицины: Непосредственно применимо к моделям митохондриальной дисфункции при нейродегенеративных и метаболических заболеваниях.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает переход от наблюдений потока ионов кальция на этапе фундаментальных исследований к доклинической валидации с использованием скорректированных сигналов fura-2-FF.
- Оптимизация процесса разработки: Позволяет принимать более надежные решения о целесообразности дальнейшего продвижения исследований за счет снижения количества ложных сигналов в анализах митохондриального кальция.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум открытий: от проверки гипотез о мишенях через идентификацию перспективных соединений-лидеров до доклинической валидации механизмов действия, в частности для митохондриальных мишеней.
- Фундаментальная биология: способствует уточнению путей передачи сигналов путем изолирования кальций-зависимых сигналов от метаболических помех в анализах на живых клетках.
- Скрининг: повышает готовность анализа к применению за счет вычитания фона и коррекции смещения, что улучшает соотношение сигнал/шум при оценке соединений.
- Аналитика: позволяет проводить количественные рациометрические измерения путем расчета R-фактора с использованием скорректированной эмиссии на 450 nm и 500 nm.
- Трансляционные исследования: связывает метод с доклинической работой посредством одновременного мониторинга уровня кальция и митохондриального мембранного потенциала с помощью TMRE.
- Корпоративное использование: создает переиспользуемую систему коррекции, применимую для различных типов клеток и флуоресцентных зондов, подверженных интерференции NADH.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования при валидации мишеней за счет устранения ложноположительных результатов, вызванных NADH, при анализе кальциевой сигнализации.
- Практическая ценность: Улучшает стандартизацию и воспроизводимость анализа благодаря систематическому определению изобестической точки и вычитанию фона.
- Стратегическая ценность: Способствует принятию более обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения биологического шума в каскадах скрининга на ранних этапах.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию митохондриальных мишеней с учетом рисков на основе надежных функциональных показателей, свободных от помех.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с флуоресцентной микроскопией и рациометрическими зондами.
- Необходимо наличие оборудования, способного осуществлять сканирование длины волны возбуждения (350–365 nm) и детектирование двойного излучения (450 nm, 500 nm).
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов измерения фонового сигнала и коррекции смещения.
- При применении метода к различным рабочим процессам подготовки клеток без красителей требуются адаптационные корректировки.
- Результат зависит от тщательного измерения сигналов фона без клеток и сигналов области клеток во избежание неправильного выбора изобестической точки.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Mitochondrial Fluoroprobe Loading
1:22
In Situ Isosbestic Fura-2-FF Point Identification
2:40
Background Signal Detection and Cell Area Correction
3:30
R Factor Measurement
4:12
Results: Representative Intracellular Ca2+ Measurement
5:15
Conclusion
