Murine линии на основе модели хронического ингибивания CDK9 для изучения широко распространенных негенетических дефектов транскрипционной удлинения (TE^{определенно}) в раках

Учитывая, что рак Тедеффа является значительным препятствием против иммунотерапии, наша фармакологическая модель является выгодным инструментом, поскольку она соответствующим образом имитирует широко распространенные транскрипционные и эпигенетические дефекты, наблюдаемые при таких раковых заболеваниях, и позволяет изучать эти негенетические аномалии, чтобы получить новые идеи, найти новое применение существующих препаратов, или найти новые стратегии против таких видов рака. Это простая в установлении и обысловимая модель для изучения транскрипционных дефектов удлинения при раковых заболеваниях, что позволяет изучать опухолевые иммунные взаимодействия как в пробирке, так и в in vivo. Этот метод также может быть применен к линиям карциномы человека.

Мы протестировали это на T47D и CAL51 в краткосрочной перспективе, что дает возможность для аналогичных TEdeff-подобных характеристик. Протокол, который мы описываем здесь, дает базовую основу для сведения к минимуму известных переменных, критически важных для генерации TEdeff-подобных функций при хроническом торможении CDK9. Тем не менее, необходимо позаботиться об оптимизации точной сублетной дозы флавопиридола для других линий мурина.

Влияние изменения плотности покрытия клеток, культурных условий, условий стимуляции цитокинов может варьироваться для различных клеточных линий мурина. Начните с извлечения полиА-положительной РНК из половины ранее рибосомных РНК-обедненных образцов с использованием магнитных бусинок oligo dT. Перепроходить шарики во флаконе вихрем в течение 30 секунд, и передать 200 микролитров бисера в трубку.

Добавьте равный объем связывающего буфера и смешайте содержимое. Поместите трубку в магнит на одну минуту, и отбросить супернатант. Затем снимите трубку с магнита и повторно наполните промытые бусы в 100 микролитров связывающего буфера.

Отрегулируйте объем рибосомного РНК-обедненного образца до 100 микролитров с 10-миллимолярной Tris-HCl при рН 7.5. Добавьте в образец 100 микролитров связывающего буфера. Нагрейте смесь до 65 градусов по Цельсию в течение двух минут, чтобы нарушить вторичные структуры РНК, а затем сразу же поместить его на лед.

Добавьте 200 микролитров общей РНК в 100 микролитров промытых бусинок и тщательно перемешайте на роторе в течение пяти минут. Поместите трубку на магнит в течение одной-двух минут, тщательно удалите все супернатанты, затем снимите трубку с магнита и добавьте 200 микролитров стирального буфера. Тщательно смешайте образец, трубя вверх и вниз несколько раз, вернуть трубку в магнит в течение одной минуты, и удалить супернатант.

Затем используйте спектрофотометр для измерения чистоты и концентрации изолированной мРНК, связанной с бисером. Используйте оставшуюся половину рибосомной РНК-обедненной выборки в качестве ввода белка А для иммунопреципиента пяти-премьер ограничен РНК с моноклональным 7-метилгуанозин антитела. Вымойте белок магнитных бусин из комплекта RIP в соответствии с протоколом производителя, чтобы предварительно связать антитела к бисеру, из 7-метилгуанозин антитела к бисеру приостановлено в 100 микролитров мыть буфера из комплекта.

Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 30 минут, вращаясь на низкой скорости. Затем центрифуга труб кратко, и положить их на магнитный сепаратор. Удалите и отбросьте супернатант, затем снимите трубки с магнитного сепаратора и повторно снимите бисер с 500 микролитров буфера стирки.

Vortex труб, центрифуга их кратко, и поместите их обратно на магнитный сепаратор, и снова отказаться от супернатанта. Затем добавьте 120 нанограмм рибосомной РНК-обедненной РНК в бисер, связанный антителами, вместе с одним микролитером ингибитора RNase и инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 60-90 минут с легким возбуждением. После инкубации, спина вниз образца в 300 раз г в течение 10 секунд, и передать супернатант с uncapped мРНК в новую трубку микроцентрифуга.

Повторите мыть еще два раза с 100 микролитров мыть буфера, и бассейн собраны supernatant. Улейте ограниченную мРНК из бисера, добавив 300 микролитров буфера лиза мочевины, подготовленных в соответствии с рукописными указаниями, и нагревая смесь до 65 градусов по Цельсию в течение двух-трех минут. Смешайте 300 микролитров элализованного образца с 300 микролитров фенола:хлороформа:изоамилового спирта, инвертировать, перемешать, и оставить на 10 минут.

Аккуратно смешайте образец снова, и центрифуга в течение двух минут. Аккуратно пипетку верхний слой к свежей трубке, и отбросить нижний слой. Добавьте в образец 300 микролитров 2-пропанола и 30 микролитров трехмолярного ацетата натрия, инвертировать его несколько раз, и положить его в минус 20 градусов по Цельсию в течение 20 часов.

После инкубации центрифугировать образец в течение 10 минут при четырех градусах цельсия. Тщательно отбросьте супернатант и высушите гранулы при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторное высасывьте гранулы в воду, свободную от нуклеаз, и измерьте чистоту и концентрацию РНК с помощью спектрофотометра.

Изолировать CD8-положительные клетки в соответствии с рукописными направлениями, а затем повторно использовать клетки в коммерчески доступных магнитного буфера системы разделения. Добавьте 100 микролитров антител на каждый миллилитр клеток и инкубировать клетки на льду в течение 15 минут. Затем добавьте 100 микролитров магнитных бусин на каждые 100 микролитров коктейля антител и оставьте клетки на льду еще на 15 минут.

После инкубации добавьте семь миллилитров буфера магнитного разделения к клеткам, ввемит три-четыре миллилитров в свежую трубку и поместите трубку на магнитную в течение пяти минут. Декант жидкости с CD8-положительных клеток в свежей трубке на льду. Затем добавьте оставшиеся три-четыре миллилитров клеток к магнитным бусинкам и поместите трубку на магнит на пять минут.

Декант второй партии CD8-положительных клеток в трубку с первой партии. Семя инженерии приверженец фибробластовых клеток SAMBOK вместе с со-стимулятор молекулы на 75000 клеток на колодец в 24-хорошо пластин, и культура их в 37-градусный по Цельсию, 5%углекислый газ увлажненной инкубатор. Через 24 часа вымойте монослой APC один раз с помощью модифицированной среды Dulbecco и добавьте 0,5 раза 10 к шести наивным клеткам в двух миллилитров среднего, дополненных в соответствии с рукописными направлениями.

Культура клеток в течение 20 часов, а затем осторожно урожай неадъедерных OT-I клеток путем сбора средств массовой информации и гранулирования клеток в 191 раз г в течение двух минут. Подсчитайте клетки и посеять их в соотношении один к одному в совместной культуре с клетками B16/F10, необработанными B16/F10-OVA и клетками B16/F10-OVA, предварительно обработанные флавопиридолом. Культура клеток в течение 20 часов в 37-градусный по Цельсию, 5%углекислый газ увлажненной инкубатор, затем удалить OT-I CD8-положительных клеток, и мыть приверженец B16/F10-OVA клеток в PBS.

Трипсинизировать три группы прикрепленных клеток в 05%EDTA с трипсином в течение пяти минут, а затем гранулировать их в 191 раз г в течение пяти минут. Инкубировать собранные клетки B16/F10-OVA в холодном PBS с красителем жизнеспособности и соответствующими помеченными антителами, а затем проанализировать жизнеспособность с цитометрией потока. Этот протокол был использован для создания транскрипции удлинения дефектной клеточной модели, которая показывает глубокую потерю фосфорилирования в положении serine 2 на C-терминале повторяющийся домен РНК-полимеразы II и значительное снижение H3K36me3, который вовлечен в определение границ экзона и ингибирование беглых загадочных транскрипций.

Клетки показывают критические дефекты обработки мРНК с увеличением соотношения неправильно ограниченных и не полиаденилатных мРНК. Кроме того, в этой клеточной модели наблюдаются специфические репрессии в отношении ключевых генов воспалительных реакций и смерти клеток при посредничестве FasL. Исследовательский анализ, чтобы проверить, если клеточная модель придает устойчивость к цитотоксической Т-клеточной атаки показывает, что хронические флавопиридола индуцированной транскрипции удлинения дефекты могут даровать средства спасения от противоопухолевой иммунной атаки.

Флавопиридол-обработанные B16/F10 клетки stably overexpressing ген OVA не были susceptible к CD8-положительным цитотоксическим T клеткам, которые имеют селективную токсичность к OVA-выражая клеткам. Клетки, не предварительно обработаемые флавопиридолом, подверглись серьезной клеточной смерти, в то время как родительский B16/F10, не выражаюй антиген OVA, выжил. Важно помнить, что снижение уровня триметилирования фосфосерин 2 и H3K36 на 25-наномолярном лечении флавопиридолом не гарантирует снижения как уровня фосшо-STAT1, так и уровня фосфо-НФ-каппаБ.

Каждая линия карциномы мыши уникальна, и JAK1 и CCNT1 могут спасти эффект флавопиридола. Кроме того, эта модель может быть использована in vivo для мониторинга устойчивости, предлагаемой раком Тедеффа против врожденных и адаптивных противоопухолевых иммунных реакций. Например, анти-asialo лечения могут быть использованы для регулирования деятельности НК-клеток, и иммунные контрольно-пропускные пункты терапии могут быть введены TEdeff опухолевых мышей.

Опухолевые лимфоциты, или TIL, нагрузка является показателем успеха в иммунотерапии. Наша модель проложила путь для нас, чтобы исследовать степень активации и истощения TILs в микроокноронации рака TEdeff как до, так и после иммунотерапии.